【研究意义】桑树为桑科桑属植物，在我国种植历史久远，种植广泛，尤其在江浙地区^[1-2]。桑叶，是桑树的叶片，性寒，味甘苦，被国家卫健委列入药食两用目录中。桑叶含有丰富的生物活性物质，如黄酮类、多糖类、氨基酸和1- 脱氧野尻霉素等^[3-5]，具有治疗肺气失和、清肝泻火气和解毒明双目等作用^[6-7]。植物叶蛋白是指从植物茎叶中提取，其氨基酸组成比一般谷物和豆类蛋白质丰富，与动物性蛋白相仿且更适合被人体消化吸收的蛋白质^[8]。植物叶蛋白含有大量人体所需的必需氨基酸和非必需氨基酸，是一种资源丰富，不含胆固醇，具有一定食用价值和药用价值的可再生新型蛋白资源，有极高的研究开发意义和价值^[9-10]。【前人研究进展】桑叶种植粗放、生产成本低廉、产量极高^[11], 在药用、食用、动物养殖方面均有相关应用。在药用方面，桑叶生物碱1- 脱氧野尻霉素为降血糖成分，黄酮类成分可抗病毒；在食用方面，近年已开发出桑叶乌龙茶、脱水桑叶菜等新产品；在动物养殖方面，可直接喂食鲜叶或桑叶干燥磨粉后加入饲料中喂食^[12]。研究表明，桑叶富含叶蛋白，叶蛋白含量占其干基重量的15%~30%^[13]，且桑叶蛋白氨基酸种类较丰富，必需氨基酸含量较高，是一种优质植物蛋白来源，符合消费者对蛋白食品的要求。但目前对叶蛋白的研究多在苜蓿草方面，对桑叶蛋白提取利用较少。我国拥有全球最丰富的桑叶资源，若仅将桑叶用于养蚕，利用有限且具有一定季节性，易造成资源费现象。目前，叶蛋白的主要提取方法有碱溶酸沉法^[14]、乳酸发酵法、膜过滤分离提取法、超声波提取法^[15-16]、发酵酸法^[17]、有机溶剂法、盐析法^[18-19]和微波提取法^[20-22]等。【本研究切入点】桑叶蛋白作为桑叶提取物，其成本低廉、来源广泛、营养丰富，对于满足当代消费者不断增长的蛋白摄入需求有重要意义。本试验通过单因素试验和响应面法探索不同条件下桑叶蛋白提取率的变化并优化提取方法。【拟解决的关键问题】本试验利用微波辅助碱法提取干燥桑叶中的叶蛋白，研究桑叶粉和浸提液之间的料液比、微波提取功率、微波提取时间、提取液pH值对桑叶蛋白提取率的影响，明确微波辅助提取桑叶蛋白的最佳试验条件。

1　材料与方法 1.1　试验材料

供试桑叶采购于浙江兰溪桑叶基地。考马斯亮蓝（北京化学试剂公司）、氢氧化钠（天津市华东试剂厂），均为分析纯。主要试验仪器包括：HM-SY96S全自动多功能酶标仪（山东恒美电子科技有限公司），L-550台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），UDK132半自动凯氏定氮蒸馏仪（日本EYELA东京理化器械株式会社），P70D20TL-D4微波炉（格兰仕电器制造有限公司）。

1.2　试验方法

1.2.1 桑叶蛋白提取流程　桑叶原料→前期预处理→热风50 ℃烘干→粉碎，过孔径74 μm筛→称取桑叶粉样品→加去离子水→加1 mol/L NaOH溶液调pH值→微波辅助碱法提取→离心→上清液中蛋白质含量测定→计算提取率

1.2.2 桑叶蛋白含量的测定　采用凯氏定氮法测定桑叶粉中的粗蛋白含量。（1）在6支离心管中分别加入1 mg/mL牛血清蛋白0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，再相应加入0.15 mol/L PBS缓冲液0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0 μL，然后在每支离心管中分别加入考马斯亮蓝G-250溶液1.0 mL，轻摇颠倒混匀，静置3 min后用移液枪吸取反应完全的溶液200 μL到酶标板孔中，测定595 nm处的吸光度，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=3.1034x-0.031，R²=0.9957。

（2）精确称量1 g（精确至0.0001 g）桑叶粉样品，按比例加入去离子水，搅拌，固定微波装载量为每组100 mL，微波辅助提取，离心，分离上清液，吸取一定体积的上清液，根据情况相应稀释后取200 μL，依照上述方法测定上清液的吸光度，根据上述标准曲线回归方程计算桑叶粉样品中的蛋白质含量。

式中，M₁为上清液中的蛋白含量（mg），M₂为桑叶干粉中的粗蛋白含量（mg）。

1.2.3 桑叶蛋白提取工艺单因素试验　以蛋白提取率为指标，选取微波功率（200、300、400、500、600、700 W）、微波提取时间（20、40、60、80、100、120 s）、pH值（8、9、10、11、12、13、14）、料液比（1:40、1:60、1 ︰ 80、1:100、1:120 g/mL）进行单因素试验，研究各因素对蛋白提取率的影响并确定最佳提取工艺参数。

1.2.4 桑叶蛋白提取工艺响应面试验　在单因素试验所得数据基础上，根据Box-Behnken中心组合试验的设计理论，选取pH（A）、料液比（B）、微波功率（C）、微波提取时间（D）对桑叶蛋白提取率影响显著的4个因素，使用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验方案设计（表 1）。

2　结果与分析 2.1　桑叶蛋白提取工艺单因素试验

2.1.1 pH对桑叶蛋白提取率的影响　由图 1可知，桑叶蛋白提取率随着浸提液pH值逐渐上升而上升，当浸提液pH为13时，桑叶蛋白提取率达到峰值23.72%。主要原因是随着提取液pH值上升，部分蛋白变性而延展，更容易溶出。但提取液pH值过高会使浸提液相对更加黏稠，对后续离心产生影响。此外，提取液pH值过高可能会导致氨基酸发生脱氨、脱羧反应，对桑叶蛋白提取液成分造成负面影响；桑叶蛋白的氨基酸组成与脱脂大豆粉基本一致^[23]，在pH12.5条件下，大豆蛋白、谷蛋白、酪蛋白等在碱性条件下进行加热处理，苯丙氨酸、异亮氨酸等必需氨基酸发生外消旋化为D- 型氨基酸，导致部分蛋白质变性而造成营养价值流失^[24-25]。因此在后续响应面试验中选取pH值3个水平分别为10、11、12。

2.1.2 料液比对桑叶蛋白提取率的影响　由图 2可知，料液比在1:40~100 g/mL范围内，桑叶蛋白提取率随着料液比的减小明显上升，当料液比达到1:100 g/mL时，桑叶蛋白提取率达到峰值32.37%，之后随着料液比的增加，桑叶蛋白提取率明显下降。主要原因是当料液比较高时，提取液黏度较高，阻碍蛋白质溶出，导致浸提出蛋白质的能力较低，从而导致可溶性蛋白提取不充分。当料液比调整至合适比例时，提取液黏度降低，可溶性蛋白充分溶解于提取液内，当料液比大于最佳比例后，可能会导致降低分散于提取液内的原料对于微波辐射的吸收，影响蛋白溶出，导致提取率不升反降。

2.1.3 微波提取时间对桑叶蛋白提取率的影响　由图 3可知，微波提取时间在20~120 s范围内，桑叶蛋白的提取率随着微波提取时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，可能是提取时间过短，桑叶蛋白没有被充分释放出来，当提取时间达到80 s时，桑叶蛋白得到了充分的释放，提取率达到最大值28.04%。之后继续增加提取时间，会引起提取温度持续升高，可溶性蛋白因热变性，疏水基团暴露，导致提取到的蛋白相应减少，提取率也随之降低。

2.1.4 微波功率对桑叶蛋白提取率的影响　由图 4可知，桑叶蛋白提取率随着微波功率的增加呈现出显著上升趋势，可能是初始微波功率过低，桑叶中的活性物质没有被充分释放，当微波功率达到500 W时，桑叶蛋白提取率达到最大值25.77%，但当微波功率继续上升，桑叶蛋白提取率呈现出单边下行的趋势，特别是在微波提取功率升至600 W后，桑叶蛋白提取率更是大幅度下降，其原因可能是由于微波功率过大时一些其他杂质也被释放出来，对蛋白质分子的破坏也随之增加。

2.2　桑叶蛋白提取工艺响应面试验结果

2.2.1 桑叶蛋白提取结果　为进一步优化桑叶蛋白提取工艺，在前期单因素试验数据的基础上，以pH、料液比、微波功率、微波提取时间为桑叶蛋白提取率影响显著的4个因素，使用Design Expert 8.0.6软件设计相应的响应面试验方案，结果见表 2。

2.2.2 响应面试验回归模型的建立　经过对响应面试验数据的多元回归拟合，得到桑叶蛋白提取率与pH（A）、料液比（B）、微波功率（C）、微波提取时间（D）响应面二次多项回归模拟方程如下：

桑叶蛋白提取率Y=35.39 + 0.93A + 1.55B + 0.032C + 1.01D - 0.073AB - 1.26AC - 0.54AD - 2.5×10^-3BC + 0.93BD - 0.84CD - 3.30A² - 8.35B² - 3.22C² - 6.55D²

根据表 2数据进行相应的方差分析，结果见表 3。此模型的回归系数R² = 0.9546，说明提取率的实际值与预测值拟合较好，决定系数R_Adj²=0.9092，说明90.92% 试验数据的变异性可以用此回归模型来解释。从表 3提取率方差分析可以看出，此模型P＜0.0001，具有极显著性。失拟误差P=0.1420＞0.05，表示失拟项不显著，该模型拟合度良好，能够较好地反映响应面的变化。

F值的大小可以反映试验各因素对试验指标影响程度的高低，F值越大表明试验因素对试验指标的影响越显著。通过对比各因素的F值（表 3）可知，在这些选用的因素水平范围内，按照对试验结果的影响依次为：料液比（B）＞微波提取时间（D）＞pH（A）＞微波功率（C）。一次项中，B极显著，D显著，二次项中，A、B、C、D极显著，交互项均不显著，表明这4个因素之间的交互效应影响较小。由此可知，每个因素对响应值引起的影响并非是普通的线性关系。

2.2.3 响应曲面分析　响应面3D图反映出每两个自变量因素之间的交互作用，可直观反映各试验因素对桑叶蛋白提取率的影响。响应曲面越陡峭表明图中两个试验因素交互影响越大，而反映两个试验因素之间交互效应的强弱则是等高线的不同形状^[26-27]。由图 5可见，料液比和微波提取时间的曲面都较为陡峭，对桑叶蛋白提取率影响相对较为显著；再由等高线图为椭圆可知，微波提取时间、pH值、微波功率和料液比之间的各交互项均不显著。

2.2.4 最佳提取工艺条件的优化及验证　根据桑叶蛋白提取率模型的二次回归方程，通过Design Expert 8.0.6对微波辅助碱法提取桑叶蛋白工艺参数进行优化，选取模型中最优提取条件，结果表明最佳提取工艺参数为：pH 11.4、料液比为1: 101.92 g/mL、微波功率为496.74 W、微波提取时间为81.6 s，此提取参数下桑叶蛋白提取率理论值为35.58%。考虑实际操作可行性，修正最佳提取参数为：pH 11.4、料液比为1:102 g/mL、微波功率为500 W、微波提取时间为82 s，采用修正后的最佳提取参数进行3次验证试验，桑叶蛋白提取率为35.84%，试验结果与理论值基本一致。可见，根据响应面法得到的优化提取参数真实准确，表明本试验所用模型适用桑叶蛋白的提取。

3　讨论

由凯氏定氮法测得桑叶干粉中粗蛋白的质量分数为20.18%，本试验采用优化后的微波辅助碱法提取工艺得到的桑叶蛋白提取率高于江洪波等^[28]采用碱法浸提工艺所得的桑叶蛋白提取率（4.42%）和朱天明等^[29]采用纤维素酶辅助提取工艺所得的桑叶蛋白提取率（6.5%），相较于碱法浸提和纤维素酶辅助提取，微波辅助碱法提取桑叶蛋白效率高，能大幅减少提取时间，提高叶蛋白提取率，为桑叶蛋白的提取提供了更多的可行方法。基于不同地区桑叶干粉的粗蛋白质量分数存在一定差异，后续可继续深入研究不同产地桑蛋白含量的差异及桑叶在不同生长时期所含叶蛋白的差异等。我国拥有世界上最丰富的桑叶资源，但利用率低及桑叶产品附加值低，本试验为桑叶蛋白在药用、食用及动物养殖领域工业化生产提供研究基础。

4　结论

本研究采用微波辅助碱法提取干燥桑叶粉中的叶蛋白，通过响应面综合考虑提取液pH值、料液比、微波功率、微波提取时间4个因素对桑叶蛋白提取率的影响，依据Box-Behnken中心组合设计原理设计了四因素三水平试验，结果表明，微波辅助碱法提取桑叶蛋白的最佳工艺参数为：pH 11.4、料液比1 ∶ 102 g/mL、微波功率500 W、微波提取时间82 s，在此工艺参数条件下桑叶蛋白提取率为35.84%。