【研究意义】随着我国居民生活水平的提升，居民对肉类产品需求增加，促进畜禽业发展。畜禽养殖业集约化发展的同时，也产生大量养殖废水^[1]，我国养猪场每年产生1.6亿t的养猪废水^[2]。养猪废水成分复杂，一般含有丰富的有机物、高浓度NH₄⁺-N、悬浮固体等成分，养猪废水中的大量含氮污染物直接排放会造成严重的水体污染和富营养化，威胁周边居民的用水安全^[3-4]。因此，为满足废水排放标准，会采用一些生物、物理或化学方法来降低污染物浓度，其中生物法通过好氧或厌氧微生物构建工艺，具有操作简单、脱氮高效、环境友好等优点^[5]。【前人研究进展】传统的生物脱氮技术通过自养硝化菌和厌氧反硝化菌将含氮有机物-氨化-硝化-反硝化成N₂达到去除氮的目的^[6]。传统工艺分为好氧和厌氧两段，且自养硝化菌的生长速度缓慢，需要较长的启动时间，从而无法广泛应用^[7]。近年来，异养硝化细菌因其生长速度快、适应能力强而受到越来越多的关注，异养硝化细菌可以在高浓度NH₄⁺-N和有机物下生长，并利用废水中的有机物作为能源进行异养硝化的同时降低有机物和氨氮浓度^[8]。与自养型硝化细菌比较，异养硝化细菌生长速率更快且适应能力更强^[9]，关于异养硝化菌的研究已经逐渐成为研究热点。目前发现的异养硝化菌主要包括假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)等^[10]。【本研究切入点】关于异养硝化细菌的应用研究主要集中于低浓度NH₄⁺-N废水，因此有必要寻找高效的异养硝化细菌来处理高浓度NH₄⁺-N的废水，如其在养殖废水中的实际应用，此外异养硝化菌在未灭菌处理的实际废水中的研究也较少^[11]。【拟解决的关键问题】本研究从某湖泊底泥中富集、分离鉴定出能有效去除NH₄⁺-N的异养硝化菌，研究其异养硝化和好氧反硝化能力，以及在不同接种比例、碳源、pH、温度、C/N、初始氨氮浓度条件下对菌株脱氮特性的影响，再以农村养殖户污水池中的养猪废水为试验对象，将该异养硝化菌用于养猪废水处理，探究其在高浓度氨氮废水中的异养硝化能力与处理养猪废水的可行性。

1　材料与方法 1.1　试验材料

筛选样品于2021年12月采自某浅水湖泊的底泥，取样后马上进行菌株筛选；养猪废水于2022年5月采自绵阳市某农村小型养殖户的污水池，保存于聚乙烯瓶中，取样后第2天用于试验。后续试验于2022年在西南科技大学实验室内进行。

异养硝化培养基：硫酸铵0.47 g/L、二水合柠檬酸钠4.08 g/L、50 mL维氏盐溶液，pH值为7.0~7.2。硝酸盐培养基：硝酸钾0.722 g/L、二水合柠檬酸钠4.08 g/L、50 mL维氏盐溶液，pH值为7.0~7.2。亚硝酸盐培养基：亚硝酸钠0.49 g/L、二水合柠檬酸钠4.08 g/L、50 mL维氏盐溶液，pH值为7.0~7.2。维氏盐溶液：磷酸氢二钾5.0 g/L、七水合硫酸镁2.5 g/L、氯化钠2.5 g/L、四水合硫酸锰0.05 g/L、七水合硫酸亚铁0.05 g/L。固体培养基需加入2% 的琼脂粉，培养基均高温高压灭菌(121 ℃、30 min)。

1.2　试验方法

1.2.1 菌株的分离与鉴定　取3份适量样品分别置于20 mL 0.9% 生理盐水中，混匀后静置，取2 mL上清液接种到异养硝化液体培养基，富集3 d，选择变浑浊的培养基进行后续研究。

取富集菌液进行梯度稀释，选择10^-5、10^-6、10^-7梯度进行平板涂布，置于30℃恒温培养箱内培养。待长出菌落，挑选不同形态菌落进行平板划线纯化2~3次。将纯化后的不同菌株接种至异养硝化液体培养基中，在30 ℃、120 r/min摇床中培养48 h后将培养液在8 000 r/min、3 min条件下离心，取上清液检测NH₄⁺-N浓度，对比不同菌株的氨氮去除率，选择效果最好的菌株进行后续研究。

观察菌株在平板上菌落的特征，并进行革兰氏染色，委托天津诺禾致源生物信息科技有限公司测序。测序结果同Blast数据库中细菌的16SrDNA进行同源性分析，用MEGA7.0构建系统发育树。

1.2.2 菌株的异养硝化性能　将活化的菌液以2% 接种比接种于异养硝化培养基中，设空白对照，在30 ℃、130 r/min条件下恒温培养。每隔4 h取样，测定培养基中菌体的细胞密度OD₆₀₀的数值，同时取样离心，测定上清液NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N的浓度变化。

1.2.3 菌株的好氧反硝化性能　将活化的菌液以2% 接种比分别接种于硝酸盐培养基和亚硝酸盐培养基中，设置空白对照，在30 ℃、120 r/min条件下培养。每隔4 h取样，测定OD₆₀₀和离心测定上清液NO₃^--N、NO₂^--N浓度。

1.2.4 菌株的脱氮特性　测定菌液接种量、碳源、pH、温度、C/N、初始NH₄⁺-N浓度等单因素对菌株的脱氮特性的影响。菌液接种量为0%、2%、4%、7%、10% 的不同接种比例；碳源包括丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖；pH为6、7、8、9、10；温度为15、20、25、30、35 ℃；C/N为2、6、10、15、20；初始NH₄⁺-N浓度为50、100、200、400、800 mg/L。固定单一因素，其余条件保持不变，将活化的菌液接种于100 mL异养硝化培养基中，设置空白对照，在摇床中培养48 h后，测定NH₄⁺-N浓度和OD₆₀₀。

1.2.5 菌株在农村养殖废水中的应用　在锥形瓶中进行简单振荡试验，研究菌株在实际养猪废水中的异养硝化能力。从绵阳农村某养殖户的污水池中采集养猪废水，用棉网过滤水中浮渣，不做灭菌处理，其初始NH₄⁺-N浓度为1 048 mg/L，用自来水稀释废水得到不同浓度NH₄⁺-N废水(500、1 000 mg/L)用于试验。柠檬酸钠用于将废水C/N比率调整为约10，将3 mL活化的菌液接种至150 mL养猪废水中(试验组)，然后在30 ℃、130 r/min下培养。以相同条件下不加异养硝化细菌的养猪废水作为空白对照，每隔12 h取样测试其NH₄⁺-N、TN、NO₃^--N、NO₂^--N的浓度。

式中，C_空白为空白对照中NH₄⁺-N浓度，C_样品为试验组中不同时间的NH₄⁺-N浓度，NH₃^--N去除率、NH₂^--N去除率计算方法与上式相同。

1.3　测定指标及方法

样品在测定前经离心处理，取上清液测定。NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法（HJ 535-2009）；NH₃^--N采用紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）；NH₂^--N采用盐酸萘乙二胺检测法（GB 7493-87）；TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（GB 11894—89）；菌体生长量以在波长600 nm的吸光度表征，采用可见分光光度计（WFJ-2100型，尤尼柯仪器有限公司）进行测定。

试验数据采用Excel 2021进行计算，使用Origin 2018绘制数据图进行分析。

2　结果与分析 2.1　菌株的筛选与鉴定

供试湖底泥经分离筛选得到11株细菌，其中1株NH₄⁺-N去除率最大、为91.8%，命名为L-1，菌株L-1属于革兰氏阴性菌，菌落呈乳白色、不透明、表面光滑。细胞呈短杆状，大小为0.7~0.9 μm×0.4~0.5 μm，电镜扫描图像见图 1。L-1的16SrDNA序列(1 415 bp)在Blast数据库中检索，发现L-1与多株Acinetobacter sp. 同源性在99% 以上。通过MEGA7.0构建系统发育树，如图 2所示，菌株L-1与Acinetobacter_sp._bB11(2011) 聚为一支，鉴定菌株L-1为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。

2.2　菌株L-1的异养硝化性能

以NH₄⁺-N为唯一氮源，菌株生长情况与氮素变化如图 3所示，菌株L-1在4 h进入对数生长期，20 h到达稳定期，OD₆₀₀达到最高值1.523，其中NH₄⁺-N的去除过程主要处于对数生长期，NH₄⁺-N浓度由100.75 mg/L降至7.54 mg/L，NH₄⁺-N去除率达到92.52%，说明菌株能有效以NH₄⁺-N为唯一氮源进行异养硝化。在NH₄⁺-N硝化过程中有少量NO₃^--N和微量NO₂^--N累积，在52 h时NO₃^--N只有0.04 mg/L，这与蒙小俊^[12]、雷强等^[13]研究相似，在硝化过程中产生NO₃^--N，随后浓度逐渐降低，可能与L-1的脱氮途径相关。

2.3　菌株L-1的好氧反硝化性能

由图 4A可知，菌株L-1以NO₃^--N作为唯一氮源时，在前24 h，菌株生长快速，OD ₆₀₀达到0.75，同时NO₃^--N浓度快速降低，去除率达到75.61%，平均去除速率为3.13 mg/（L·h），反硝化过程中有少量NO₂^--N累积，其浓度先升后降，累积量不超过0.9 mg/L。由图 4B可知，以NO₂^-作为唯一氮源时，与NO₃^--N为氮源时不同，其达到稳定期时间延长，生物量最大为0.49，说明高浓度NO₂^-会抑制了微生物的生长，但菌株仍能利用NO₂^-，最终NO₂^-去除率为83.23%。

2.4　环境因素对菌株L-1脱氮的影响

由于培养基中的营养物质有限，不同的接种量影响微生物的生长速度，进而影响微生物的硝化性能。从图 5A可以看出，不同的接种量下各处理OD₆₀₀和NH₄⁺-N浓度均发生不同变化，其中，2% 的接种比的培养基中菌株生长状况最好，在48 h后，OD₆₀₀达到1.056，NH₄⁺-N去除率达到86.68%，具体为OD_600-2% > OD_600-4% ≈ OD_600-7% > OD_600-10%。

环境中pH或温度的变化，微生物的酶活性都会受到影响，当pH和温度过高或过低，硝化细菌生长都会受到抑制^[14]。如图 5B所示，当pH为6、7、8、9时，NH₄⁺-N去除率均在90% 以上，OD₆₀₀均在1.3以上，说明弱酸、中性、弱碱条件下，L-1均能正常生长并进行异养硝化。其中pH为9时，菌株生长量最好，NH₄⁺-N去除率达到95.68%，而pH升高到10时，OD₆₀₀没有增长，说明L-1在过碱性条件下生长完全受到抑制^[15]。如图 5C所示，在15 ℃条件下，菌株生长速度缓慢，几乎停滞，NH₄⁺-N去除率仅为5.36%，20、25、30 ℃下菌株L-1生长迅速，48 h后OD₆₀₀分别达到1.313、1.230和1.161，其中20 ℃下NH₄⁺-N去除率最高、达到91.99%；但当温度继续升高至35 ℃时，OD₆₀₀降低至0.634，脱氮效果降到66.49%，说明L-1的适宜温度为20~30 ℃。

C/N比直接影响硝化细菌生长，如图 5D所示，C/N为10、15、20时，OD₆₀₀均大于1.0，NH₄⁺-N去除率均在88% 以上，最高达到95.78%；C/N降低为6时，NH₄⁺-N去除率和OD₆₀₀分别为72.46%、1.052；当C/N为2时，L-1生长缓慢，NH₄⁺-N去除率仅有31.03%，说明低C/N条件下菌株的生长和硝化作用受到抑制^[16]。菌株L-1的适宜C/N范围为10~20。

菌株对不同碳源的利用能力如图 5E所示，L-1以柠檬酸钠作为碳源时，NH₄⁺-N去除率和生长情况最好，去除率达到90.16%，OD₆₀₀达到最大1.269；以丁二酸钠、乙酸钠为碳源时NH₄⁺-N去除率分别为69.09% 和68.79%；而以葡萄糖为碳源时，L-1生长情况最差，相应地除氨效果也较差，去除率仅为6.77%。

菌株L-1在不同初始NH₄⁺-N浓度中的生长与硝化效率如图 5F所示，初始NH₄⁺-N浓度在50~800 mg/L时，L-1均能生长。因为NH₄⁺-N既是污染物又是营养物质，故NH₄⁺-N浓度在50 mg/L时，NH₄⁺-N去除率最高为94.59%，OD₆₀₀为0.727；当NH₄⁺-N浓度上升到为100、200 mg/L时，NH₄⁺-N去除率开始下降，分别为86.18%、46.34%；NH₄⁺-N浓度继续上升到400、800 mg/L时，此时NH₄⁺-N去除率大幅下降，分别为23.71%、16.53%。

2.5　菌株L-1在农村养猪废水中的脱氮效果

如图 6A所示，在空白对照中，NH₄⁺-N浓度有缓慢下降趋势，可能是养猪废水未做灭菌处理，其中存在脱氮菌，但其效果一般。加入菌液后，NH₄⁺-N去除效果显著提升，在NH₄⁺-N浓度为1 000 mg/L、处理96 h后，NH₄⁺-N浓度降至298.46 mg/L，去除率为70.15%，比未添加菌液的空白对照高45.78%。如图 6B所示，在1 000 mg/L废水中，加入菌液后不仅去除大量NH₄⁺-N，同时去除80.21% 的NO₃^--N和60.53% 的NO₂^--N，说明在废液中菌株L-1进行了异养硝化和好氧反硝化。

3　讨论 3.1　菌株L-1的异养硝化和好氧反硝化性能

本试验筛选出一株异养硝化-好氧反硝化细菌L-1，鉴定为不动杆菌。菌株L-1能利用NO₃^--N和NO₂^--N作为氮源进行生长，说明L-1能进行反硝化作用，这与Acinetobacter pittii SY9^[17]、Pseudomonas HNM-4^[18]等异养硝化-好氧反硝化菌结果相似。研究菌株L-1异养硝化和好氧反硝化性能发现，去除氮素与菌株生长量呈正相关，但不同氮源中的菌株生长量不同，其中NH₄⁺-N > NO₃^--N > NO₂^--N，这与AHP123^[19]在不同氮源中的生长情况相似。由上推测菌株L-1的反硝化途径属于传统反硝化途径。

3.2　菌株L-1不同条件下的脱氮特性

异养硝化细菌的硝化性能受多个环境因素影响，本试验主要研究了接种比、pH、温度、C/N比、碳源、初始NH₄⁺-N浓度6个因素对L-1的生长与硝化性能的影响。微生物生长需要适宜的pH，过高过低都会影响到酶活性，pH对微生物絮团的NH₄⁺-N转化效率和絮团细菌活性均有影响^[14]。试验得出菌株L-1的适应pH范围在6~9，与梁贤等^[20]研究结果相似。温度也是影响细菌生长的因素之一，温度从20 ℃上升到35 ℃时，L-1的OD₆₀₀逐渐下降，硝化性能减弱，因此在实际应用时，应考虑pH和温度对硝化细菌的影响。

郑冰冰等^[21]研究不同C/N对处理养殖废水的影响时，发现低C/N下，碳源不足会影响微生物生长，导致脱氮效果较差，选择适宜的C/N有利于微生物快速生长。本试验结果与郭少鹏等^[22]得出的最佳C/N为12、孙将等^[23]研究的最佳C/N为15的结果相似。废水中C/N比普遍较低，而菌株L-1适宜更高的C/N比，在后续L-1处理低C/N比的废水时需要考虑调节C/N。

碳源是微生物生物量累积和生命活动的能量来源，不同碳源对其硝化能力有直接影响^[24]。L-1在以葡萄糖为碳源时，硝化性能较差，与Acinetobacter sp. ND7的结果^[25]一致，相较于葡萄糖，柠檬酸钠等无机碳源结构简单更容易被微生物吸收利用^{[19, 26]}。本研究中最佳碳源为柠檬酸钠，这与朱晓明等^[27]分离的菌株XK51、谭俊杰等^[28]分离的菌株ADM-42、郑建龙等^[29]分离的菌株DG-3的最佳碳源均为柠檬酸钠相同。在处理废水或调节废水C/N时，应选择能被高效利用的碳源。逐步提高初始NH₄⁺-N浓度，当NH₄⁺-N浓度在800 mg/L时，L-1的异养硝化能力明显下降，但其仍然可以生长且NH₄⁺-N浓度下降，说明L-1能够耐受高浓度NH₄⁺-N脱氮，NH₄⁺-N去除率较低的原因可能是处理时间不足^[30-31]。故后续可研究其在含高浓度NH₄⁺-N的养殖废水中脱氮能力。

3.3　菌株L-1在农村养殖废水中的应用

养猪废水含有高浓度的NH₄⁺-N，直接排放会严重破坏水体环境，所以必须降低氮素浓度。本试验采集发酵中的养猪废水，将菌株L-1投加到未灭菌的废水，经处理96 h后，对氮素去除效果明显。与CAO等^[11]处理配制的废水和Klebsiella oxytoca YZ-12^[13]处理灭菌后的废水不同，采集的废水来自发酵池且未做灭菌处理，其成分更加复杂，菌株L-1可能会受到其他微生物的影响，L-1对NH₄⁺-N去除不彻底，后续可以驯化L-1在实际养猪废水中的适应能力以及串联曝气装置^[32-33]，提高对氮素的去除效果。

4　结论

从湖泊底泥中筛选出一株异养硝化-好氧反硝化菌株，经分子生物学鉴定初步确定为不动杆菌(Acinetobactersp)，命名为L-1，菌株L-1不仅能去除NH₄⁺-N，还能进行好氧反硝化去除NO₃^--N、NO₂^--N。通过单因素研究菌株L-1的脱氮特性结果显示接种比例为2%、碳源为柠檬酸钠、pH为6~9、温度20~30 ℃、C/N为10~20、初始NH₄⁺-N浓度为50 mg/L时氨氮去除率最高；在实际养猪废水中投加L-1进行脱氮，1 000 mg/L NH₄⁺-N废水中氨氮去除率为70.15%，与空白组对比NH₄⁺-N去除率提高45.78%，且废水中的NO₃^--N、NO₂^--N浓度分别降低了80.21% 和60.53%，表明L-1在实际废水中具有一定异养硝化-好氧反硝化能力。