【研究意义】李（Prunus salicina L.）属蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物，李属分类复杂且较难区分，世界上共有30~40种^[1]，国际上将李亚属分为杏组（Sect. Armeniaca）、真李组（Sect. Euprunus）和樱李组（Sect. Prunocerasus）^[2]。真李组包括中国李（Prunus salicina Lindl.）、杏李（Prunus simonii Carr.）、乌苏里李（Prunus ussuriensis Kov. & kost.）、欧洲李（Prunus domestica L.）、樱桃李（Prunus cerasifera Ehrh.）及黑刺李（Prunus spinosa L.）等6种，其中商品李为二倍体的中国李（又称日本李）和六倍体的欧洲李^[3]。我国李属植物分布广、适应性强，在浙江、福建、广东、云南、四川、陕西、东北等地均有驯化栽培的品种^[3]，其资源种类及数量均居世界第1位^[4]。黑龙江省位于我国最北区域，李的抗寒种质资源丰富，与其他作物相比，李的经济效益比较显著^[5]。由于优质、大果、耐贮运材料稀少，加之传统育种方法耗时长、成效低，亟需借助分子生物学手段加快育种进程。高质量遗传图谱的构建是分子标记辅助育种的基础。【前人研究进展】随着分子生物学的快速发展，DNA分子标记技术已经成为一种重要研究方法广泛应用于分子鉴定^[6]、杂交种纯度分子检测^[7]、种质资源多样性^[8-9]、分子遗传图谱构建^[10]、遗传多样性分析^[11-13]及指纹图谱构建^[14-15]等多个领域。DNA分子标记是遗传图谱构建的主要手段，孙文英等^[16]利用AFLP分子标记技术构建梨（Pyrus L.）的遗传连锁图谱。艾小艳等^[17]概述了构建桃（Prunus persica L.）遗传图谱的多种分子标记方法，包括基于第一、第二代分子标记的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）、SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）和RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机引物扩增多态性DNA）技术以及基于第三代分子标记的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）技术。另外，Linge等^[18]也利用SNP技术构建桃的高密度遗传图谱。章秋平等^[19]利用SSR和SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）标记构建了两张杏（Prunus armeniaca L.）遗传连锁图谱。Dang等^[20]通过SRAP、AFLP和ISSR（Inter-simple Sequence Repeat，内部简单重复序列）标记构建芒果（Mangifera indica L.）遗传连锁图谱。由此可见，通过分子标记技术构建遗传连锁图谱是切实可行的方法之一。分子遗传连锁图谱主要用于性状定位、分子标记辅助育种及功能基因克隆研究等，同时在遗传学、遗传分子育种及功能基因组学等方面发挥重要作用^[21-23]。此外，对于遗传背景复杂的木本植物而言，“双假测交”理论的提出为多年生果树遗传图谱的研究提供了理论依据^[24]。【本研究切入点】目前，国内外有关李的研究主要集中在种质资源调查^[3]、遗传多样性^[25-26]、果实性状分析^[27]等方面，而关于李遗传连锁图谱构建方面的研究鲜见报道^[28]。东北地区独特的地理环境和丰富的李种质资源，有利于开展优质、抗寒新品种的选育工作。如前所述，分子标记辅助育种技术可以加快育种进程，而遗传连锁图谱又是分子辅助育种的基础。【拟解决的关键问题】本研究以东北地区品种吉林6号和龙园秋李作为亲本，以其F 1后代作为作图群体，通过ISSR和SRAP分子标记构建李的遗传连锁图谱，为后续李的分子辅助育种提供理论依据，推进优质、抗寒李品种的选育。

1　材料与方法 1.1　试验材料

供试材料来源于黑龙江省农业科学院园艺分院，以吉林6号和龙园秋李为亲本材料，其中母本为吉林6号，树势矮小，果实较小，平均单果质量40 g，果实成熟时为红色，离核，8月中旬果实成熟；父本为龙园秋李（九三杏梅×台湾李），抗寒、丰产、树姿直立，耐红点病；果实扁圆形，平均单果质量75 g，最大果质量110 g；成熟时全面紫红色，半离核，较耐贮运，9月初果实成熟，是北方寒地果实最大品种。

以F₁子代实生苗为作图群体，选取80个F₁子代进行样本采集。杂交群体于2009年杂交，2010年播种，2012年定植于黑龙江省农业科学院园艺分院核果试验园，长势较好，稀有开花结果，没有进行剔选。同时对F₁子代进行连续两年的数据调查，调查内容包括部分生长性状和果实性状，其中叶片长、宽和果实横径、纵径经数据分析呈正态分布（数据未显示），用于QTL定位分析。

1.2　试验方法

1.2.1 DNA提取　分别采集吉林6号和龙园秋李亲本及F₁子代植株的幼嫩叶片，于-80℃冰箱中保存备用。根据天根植物DNA提取试剂盒（DP305）的相关步骤进行DNA的提取，提取后采用1.0% 琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量的检测，电泳缓冲液为1×TAE，观察并拍照，用于后续引物筛选及遗传图谱的构建。

1.2.2 F₁子代真实性鉴定　根据本课题组前期工作积累，选取特异性条带清晰的SSR引物UDP96-005（F′GTAACGCTCGCTACCACAAA、R′CCTGCATATCACCACCCAG）来鉴定子代的真实性，比较F₁群体与双亲的基因型，去除后代中与双亲基因型不一致的植株。

1.2.3 ISSR及SRAP引物筛选　试验所用的ISSR引物从UBC800-UBC900中随机选取44条，SRAP引物采用已公布的引物序列^[29]，由me1-me10及em1-em20组合成200对引物进行筛选，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

对亲本材料和2个杂交后代基因组DNA进行ISSR和SRAP引物筛选，试验选取PCR扩增条带清晰、重复性好且多态性较丰富的14条ISSR引物（表 1）和16对SRAP引物（表 2）用于后续研究。

1.2.4 PCR扩增　ISSR-PCR反应体系为20 μL：10 × PCR Buffer 2μL，引物（50 pmol /μL）2 μL，dNTP（each 10 mmol/L）0.4 μL，模板（DNA）1 μL，Taq Plus DNA Polymerase（2 U/μL）0.5 μL，加ddH₂O 14.1 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，52~62℃退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。1.5% 琼脂糖凝胶，1×TAE，150 V，100 mA，30 min电泳观察。

SRAP-PCR反应体系为15 μL：Taq PCR Master Mix，7.5 μL，正向引物（50 pmol /μL）1 μL，反向引物（50 pmol /μL）1 μL，模板（DNA）1μL，加ddH₂O 4.5 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸8 min；4℃保存。1.5% 琼脂糖凝胶，1×TAE，150 V，100 mA，30 min电泳观察。

1.3　数据分析

根据Join Map 4.0软件中CP作图模型（hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg、ab×cd等5种分离类型）的要求，将PCR所得凝胶结果在Excel中按照模型要求进行数据录入，将作图群体个体数和每个个体的基因型横向录入，将引物位点名称和分离类型纵向录入，其中hk×hk（双亲均为杂合的基因型，h对k为显性）、nn×np（母本为纯隐性基因型nn、父本为杂合基因型np，p对n为显性）、lm×ll（母本为杂合基因型lm、父本为纯隐性基因型ll，m对l为显性），选用LOD值为0.5~10.0的连锁群，采用Kosambi函数计算图谱距离。本试验引物编号为引物名+ 条带分子量，用于构建李遗传图谱。

2　结果与分析 2.1　DNA提取

采用植物DNA提取试剂盒，分别对2个亲本及80个F₁子代进行DNA提取，提取后采用1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。部分电泳结果见图1，图 1显示基因组DNA条带完整无降解。

2.2　F₁子代真实性鉴定

根据双亲基因型和子代群体的基因型，挑选出与双亲基因型不符的子代，通过筛选有72个个体为真实性子代，用于后期群体验证。F₁子代真实性部分鉴定结果见图 2，根据亲本条带分布对子代条带进行对比分析，如图 2子代2和子代10箭头所示，出现亲本中没有的条带，被鉴定为非真实性子代，排除群体之外。

2.3　分子标记的多态性分析

首先将44条ISSR引物、200对SRAP引物在亲本和2个真实性后代中进行多态性筛选，根据PCR凝胶结果分析得知，44条ISSR引物中有14条引物条带稳定且清晰，引物比例为31.8%，ISSR和SRAP获得的标记数量如表 3所示，ISSR引物产生等位基因数为74个，每条引物均产5.3个；200对SRAP引物中有16对具有多态性，引物比例为8.0%，SRAP引物产生等位基因数为46个，每对引物均产2.9个。本研究将筛选出的14条ISSR引物和16对SRAP引物进行亲本和72个F₁后代的PCR扩增，以构建遗传图谱。引物在F₁群体中产生标记位点120个，经χ²检验后，偏分离位点有9个，频率为7.5%。

2.4　标记分离分析

利用ISSR和SRAP分子标记对李F₁后代进行亲本和群体检测，发现多态性标记在作图群体中有不同的分离类型，根据Join Map 4.0软件中的CP作图模型，将亲本及F ₁后代的基因型划分为hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg和ab×cd等5种类型，每种分离类型在ISSR和SRAP标记中的数量如表 3所示，nn×np类型总数相对较高。hk×hk型分离比例为1 ︰ 2 ︰ 1（图 3A），nn×np型（图 3B）、lm×ll型（图 3C）分离比例为1 ︰ 1，ef×eg型如图 3D所示，ab×cd型如图 3E所示。

2.5　分子遗传连锁图谱的构建

将获得数据导入Join Map 4.0软件的CP模型中，将LOD=5.0设置为标记连锁群，同时将偏分离的9个标记去掉，对120个标记位点进行分析，成功构建了李遗传连锁图谱，该图谱包含38个标记，其中ISSR标记31个、SRAP标记7个，分布在16个遗传连锁群内，如图 4所示。该遗传图谱在李基因组中覆盖528.5 cM，标记间平均图距13.9 cM，连锁群LG1最长（71.1 cM），LG4最短（9.6 cM）。分布在连锁群上的标记数最多为4个，最少为2个。多态性标记间最大遗传距离为52.8 cM，位于LG5的ISSR842-2250与me1em20-700之间；最小遗传距离为1.4 cM，位于LG4的ISSR880-500与ISSR880-600之间。

3　讨论

遗传研究和分子育种方法需要基本的基因组资源，如分子标记和连锁图谱。为开发李遗传研究资源，本研究利用分子标记方法构建李遗传连锁图谱。李为多年生木本植物，遗传背景复杂，且为异花授粉植物，很难获得自交群体^[30]，而“双假测交”理论可以很好地解决这一难题，为李的遗传图谱构建和分子辅助育种提供了理论依据。同时，对遗传图谱构建来说，用于作图的亲本和群体选择尤为重要，遗传图谱作图亲本的选择应以遗传背景差异较大、亲缘关系较远为好。本研究选择吉林6号和龙园秋李为作图亲本，依据前期遗传多样性分析结果显示，两者亲缘关系较远^[31]，符合遗传图谱亲本选择的要求。另外，关于作图群体数量的阐述，章秋平等^[23]研究表明，核果类果树遗传图谱群体大小范围为48~297株子代不等，本研究通过F₁子代真实性鉴定，72株植株为真实性子代，群体数量适宜进行遗传图谱构建的研究。

分子标记方法具有引物通用性好、操作简单易行、多态性好且分布均匀等优点，被广泛应用于许多林木的遗传连锁图谱构建中^[32-33]。本研究利用ISSR和SRAP分子标记，通过多态性筛选选出14条ISSR引物和16对SRAP引物来构建李的遗传连锁图谱。通过查阅文献得知，关于分子标记引物个数和标记方法的选择，不同研究存在较大差异。战晴晴等^[34]利用28条ISSR和14对SSR多态性引物构建了北柴胡（Bupleurum chinense DC.）遗传连锁图谱，包含72个ISSR和8个SSR位点；王晓敏等^[35]利用14对SRAP引物组合、9条ISSR引物及10对TRAP引物构建了金针菇（Flammulina filiformis）分子遗传连锁图谱，获得185个标记位点，其中SRAP标记76个、ISSR标记33个、TRAP标记74个、不亲和性因子位点2个。本研究中，共产生120个清晰稳定的标记位点，其中ISSR标记74个、SRAP标记46个，最终有38个标记，其中31个ISSR标记和7个SRAP标记。由此可见，不同标记的组合选择可以最大程度地覆盖基因组，有利于增加图谱密度和提高图谱质量。

有研究表明，李是一种自交不亲和的二倍体种（2n=2X=16）^[36]，Juan等^[37]对日本李进行SNP连锁分析，获得8个连锁群，同时将不同性状进行QTL定位，其中果实成熟时间定位在LG4上，果皮颜色定位在LG3和LG4上。Basilio等^[38]利用GBS（Gnotyping-by-Sequencing）方法获得日本李高质量SNP标记1 441个，分布在8个连锁群内。本研究获得的连锁群数为16个，与上述研究结果不一致，可能原因是本研究采用的分子标记方法较少，获得的标记数较少，在基因组中分布较分散导致的，可以通过增加后代和分子标记的数量来缩小差距、提高连锁图谱的密度和分辨率。本研究结果丰富了李遗传连锁图谱的分子标记类型和标记位点，能更好地为李的基因定位和分子遗传育种提供理论依据。

4　结论

本研究构建了李遗传连锁图谱，以东北地区吉林6号和龙园秋李为作图亲本，利用SSR分子标记方法筛选出72个真实性子代。分别利用14条ISSR引物获得74个等位基因，16对SRAP引物产生46个等位基因。对PCR扩增结果进行条带分析，获得亲本及F₁后代的5种基因型，分别是hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg和ab×cd，其中nn×np类型数目相对较高。引物在F₁群体中产生标记位点120个，经χ²检验后，偏分离频率为7.5%，利用Join Map 4.0软件的CP作图模型进行Kosambi函数计算，构建含有16个连锁群的连锁图谱，包含38个分子标记位点，覆盖基因组长度为528.5 cM。李遗传连锁图谱的成功构建可以推进东北地区李优质、抗寒新品种的选育和生产实践。