2022, Vol. 49文章信息
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基金项目
- 广西自然科学基金（2018GXNSFAA281208和2019GXNSFBA245062）；广西科技开发项目（桂科AB18221112）；广西北部湾海洋珍稀物种养护自治区重点实验室项目（2021ZB01）
作者简介
- 毛美琴(1996-), 女, 在读硕士生, 研究方向为水产动物疾病防控, E-mail: 1319556719qq.com.
通讯作者
- 蔡小辉(1982-), 女, 博士, 副研究员, 研究方向为水产动物疾病防控, E-mail: Caixiaohui66@163.com.
文章历史
- 收稿日期：2022-01-05
细胞培养技术起始于20世纪初, 最初以未离散的组织小块进行培养, 组织小块呈放射状迁移出细胞[1]。迄今为止, 细胞培养已有100多年的悠久历史。1640年荷兰眼镜商詹森首次制成了世界上第一台放大倍数约10~30倍的复式显微镜, 细胞培养的研究工作逐步展开[2]。英国物理学家Hooke利用显微镜观察软木片, 由此人类发现了世界上第一个植物细胞。随后美国生物学家Harrison利用淋巴液作为培养基, 从蝌蚪脊索中成功分离出神经组织, 观察到神经细胞突起的生长过程, 证明细胞在离体条件下可以存活, 细胞培养在世界上逐渐揭开序幕[3]。该技术激起了广泛医学科学研究人员的兴趣, 细胞体外培养具有形态一致、遗传背景相似和重复性好等优点, 可作为良好的实验对象。基于各种动物组织易获性的优点, 更多组织被选用为研究对象, 研究过程中发现鸡胚组织的原代细胞可提供各种类型的细胞, 后来多采用哺乳动物作为研究对象, 尤其啮齿动物组织具有可形成连续细胞系的优点[4-5]。
起初, 为避免正常体内自体调节和应激反应可能产生的整体因素影响, 细胞培养技术多应用于医学相关研究(如抗病毒疫苗、肿瘤发生机制)。随着生物技术的发展, 研究人员发现细胞系可作为研究病毒的发生器、信号转导通路[6-7]。在低等脊椎动物和无脊椎动物的发育过程中表现出的特性(如再生功能、变态发育等), 加之近年农业病害防控需要, 特殊种类细胞培养吸引了许多研究人员的关注。已有大量研究证明, 细胞培养技术在现代生物化学、分子生物学、病毒学、环境毒理学、免疫学以及现代医学领域展现出巨大发展潜力[8]。
随着水产养殖经济效益逐年递增, 淡水和海水病害防控、环境等问题使得鱼类健康发育和病理发生等研究受到了更多关注。近年来各类鱼类细胞系不断被建立, 如金鱼(Carassius auratus)、斑马鱼(Brachydanio rerio var)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、鲤鱼(Cyprinus carpio)和鲑鱼(Oncorhynchus keta)等。新细胞系的建立对于基因组学研究、病毒与宿主互作以及细菌的鉴定和重金属的毒性分析、干细胞功能研究等具有促进作用。本综述将围绕鱼类细胞培养历史、应用和培养技术进行介绍。
1 鱼类细胞培养历史1962年, Wolf等[9]建立了第一个真骨鱼类永久细胞系虹鳟性腺细胞系(RTG-2)。1962- 1980年是鱼类细胞系建立的起步阶段, Cravell等[10]建立了鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis) 肌肉细胞系(FHM)。20世纪中期用于细胞培养的组织也越来越丰富, 将肝、脾、性腺、鳍条、皮肤等组织到鱼体几乎所有组织, 以及鱼类细胞成功应用到免疫系统、疫苗等研究领域。例如, Matsumoto等[11]从金鱼红细胞肿瘤中建立了永生性细胞系(GEM-81), 并利用该细胞系进行注射免疫等研究; Noga等[12]分别建立了胡子鲶(Clarias batrachus) 的肾脏细胞系(K1K)、鳃细胞系(G1B)、性腺细胞系(GD Ⅱ), 并在K1K中进行了鲶鱼病毒(CCV)的灭活疫苗研究; Collodi等[13]建立斑马鱼的胚胎细胞系, 是体外分离与培养模式鱼类胚胎干细胞研究的开始。
我国研究鱼类细胞起始于20世纪70年代, 张念慈等[14]为研究病毒性鱼类, 在我国首次建立了草鱼(Ctenopharyngodon idellus) 吻端细胞系ZC-7901及亚株ZC-7901S1。近年来, 由于鱼类人工养殖特别是高密度集约化养殖条件与天然环境差别很大, 导致病害大规模暴发, 鱼类细胞培养技术逐渐受到重视。应用于病毒学、毒理学、免疫学等的细胞系不断被建立, 如鲫鱼(Carassius auratus auratus)的囊胚细胞系(CAB-80)、草鱼的肾脏细胞系(CIK)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)的尾鳍细胞系(TQ-8801)等[15-18]。特定的组织被用来研究病原体的特定功能和病理生理学, 例如, 鱼类肝脏细胞主要用于毒理学研究, 头肾和脾脏细胞用于免疫研究, 而鳃细胞则用于致病性研究[19]。其中淋巴细胞和巨噬细胞主要来源于头肾, 用于研究病原体鱼体宿主之间的关联和清除能力[20-21]。另外, 鱼类细胞系对于研究不同污染物对鱼类遗传毒性、鱼类生理学和遗传学等具有重要作用。
据统计, 1994年全世界共建立了159个鱼类细胞系, 其中包含了125株淡水鱼类和溯河洄游性鲑科鱼类的细胞系, 分别来源于21科52种鱼类的不同组织; 34株海水鱼类细胞系, 分别来源于13科22种鱼类的不同组织[22]。截至2021年, 全世界共建立了1 128株鱼类细胞系[23]。
2 鱼类细胞的应用鱼类细胞作为体外研究的重要工具, 具有培养时间和培养温度适应范围较大、培养基选择范围较广、易于分离培养等特点, 因此受到水产动物研究人员的关注。鱼类细胞培养技术早前多应用于鉴定新出现的病毒性研究, 目前已广泛应用于环境毒理学、免疫学、鱼类生理学和种质资源保存等方面研究[24]。
2.1 鱼类病毒学在水产动物养殖过程中, 许多重要的经济水产动物易受传染性病毒影响, 常见病毒如石斑鱼(Epinephelus spp)虹彩病毒(SGIV)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara) 神经坏死病毒(RGNNV)、鲑鱼呼肠孤病毒(CSV)、锦鲤(Cyprinus carpio)疱疹病毒(KHV)、鳗鲡(Anguilla japonica)疱疹病毒(HVA)、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)湖病毒(TiLV)和传染性胰腺坏死病毒(IPNV)等。病毒性疾病的暴发易引起水产动物大规模死亡, 造成严重的经济损失, 极大阻碍了水产养殖的发展。鱼类细胞培养技术的建立, 解决了鱼类病毒分离鉴定的技术难题, 并且利用细胞培养能够使病毒在体外持续生长分裂, 培养条件易于控制, 不受其他病毒的隐性干扰。如今细胞系已成功应用于从病变组织中分离病原体, 研究机制包括病毒在机体内的感染、复制和释放等[25]。例如, 利用卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) 脑细胞系TOGB来测定病毒易感性, TOGB在第45代时转染效率为64.8%, 试验表明该细胞适合外源基因的表达[26]。对鱼类不同组织样本进行病毒敏感度检测, 发现鱼鳍是病毒的主要发生位点, 可作为检测病毒的有利工具。Jun等[27-28]利用鲤鱼鳍细胞系感染弹状病毒(SVCV), 研究其在弹状病毒感染中免疫基因表达和抗病毒机制。鱼类疾病预防和疾病诊断在水产养殖中占据重要地位, 通过建立鱼类细胞系可从源头了解病毒侵染途径, 有利于筛选抗病毒的疫苗开发[29]。
2.2 环境毒理学工农业兴起的同时大量污染物和有害重金属进入水生生态系统(如铜、汞、镉、铅和其他化学污染物), 严重影响水产养殖业, 水环境中聚积的有害物质具有不可降解性和较长的生物半衰期, 鱼类长期生活在该环境中直接给人类带来健康风险[30-31]。过去的毒理实验大多在活鱼体内进行, 实验过程需要大量养殖设备, 中途需要不断充气和换水, 消耗巨大的人力和物力, 且实验周期长。另外, 活体实验过程中存在不可控因素, 如试验活鱼代谢、应激反应等难以控制导致实验结果重复性较差。过往的研究表明, 鱼类细胞具有高度敏感性和重现性, 可用于废水评估, 尤其是水环境的整体毒性、毒性评估鉴定和基于有毒物质对于水生动物的相互作用研究[32-33]。
金属、化学物质及其衍生物广泛应用于各行各业, 不同程度地暴露于人类和动物中, 将斑马鱼胚胎细胞和人单核细胞系(THP-1)分别暴露于金属纳米颗粒, 研究结果表明, 金属纳米颗粒对斑马鱼和人类的细胞形态和生理有显著影响; 采用不同浓度的1, 2, 4-三氯苯对体外培养的斑马鱼肝细胞进行毒理实验, 结果表明, 水中残留的1, 2, 4-三氯苯可导致斑马鱼肝细胞DNA损伤作用。相关研究结果证明这些金属纳米颗粒、化学污染物对于人类和环境可能造成毒理学的影响[34-37]。因此, 建立鱼类细胞系研究水生环境中农药、抗生素和重金属等环境污染物具有重要意义[38-39]。近年微塑料生态毒性也激起了相关研究人员的兴趣, 可将鱼类细胞作为模型, 评估微塑料对鱼类细胞的毒性[40]。鱼类细胞作为检测环境污染物的重要生物工具, 有望发展为常见有毒污染物的生物指示物。
2.3 鱼类免疫学鱼类在水环境中与病原密切接触, 是研究动物免疫模型重要的角色之一, 鱼类细胞系的建立为天然免疫基因功能分析提供了可行工具。在鱼类中参与免疫防御的器官主要有头肾、鳃、脾、胸腺和皮肤, 其中头肾组织类似于哺乳动物的造血器官, 由免疫细胞组成, 可用于硬骨鱼免疫的发育和功能[41]。鱼类免疫系统中包含有许多细胞因子, 主要行使非特异性和特异性免疫防御, 维持机体内环境的稳定。利用细胞因子可作为标记物用于检测鱼类的先天性免疫反应[42]。稳定的细胞系建立有助于低等脊椎动物免疫功能的研究, 当虹鳟单核细胞系(RTS11)受到外界刺激后促炎细胞因子(IL-1β、TNFα和IL-6)和抗炎细胞因子(IL-10)等的表达发生显著上调, 产生的细胞因子可用于疾病治疗[43]。斑马鱼胚胎细胞系(ZBE3)具有高转染效率, 可作为鱼类免疫反应有用的研究工具[44]。而通过研究冷水鱼类细胞在不同温度下的免疫调节, 得出冷水鱼依赖先天性免疫以抵抗感染[45]。因此, 鱼类新细胞系的建立有助于研究免疫调节基因, 是疾病预防控制及疫苗开发的重要免疫模型。
2.4 干细胞研究长期以来, 以贸易为目的过度开发动物、引进非本土生物、生态污染、气候变化和跨界疾病, 使得水生生物多样性受到严重威胁。鱼类细胞系的建立对鱼类种质和基因资源具有有效保护[46]。其中胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ESC)是克隆性增殖、自我更新、功能上原始的细胞, 具有分化为几种或所有器官功能细胞类型的潜能, 是发育生物学中强有力的实验工具[47]。在胚胎和胎儿时期干细胞的目的是促进机体的初始发育和生长, 而在成体中承担着机体所有组织的自然修复作用。目前, 已在各类低等脊椎动物发现其拥有这些能力, 包括鱼类。
斑马鱼因固有的透明度和具有高度遗传保守性, 现已成为研究造血发育的一个热门模型动物, 近年建立了稳定斑马鱼干细胞系, 包括斑马鱼胚胎干细胞系(Z428)、斑马鱼胚胎机制干细胞系(ZEST)、斑马鱼胚胎祖细胞系(HSPC)[48-49]。另外, 尼罗罗非鱼胚胎干细胞(TES1)在体外和体内都具有多功能性和分化潜能, 为后续再生功能性的生物医学研究工作奠定了基础[50]。
3 鱼类细胞培养技术 3.1 培养方法细胞培养技术的标准化促使许多适用于生物化学和分子分析的细胞系被建立。相较于哺乳动物, 鱼类细胞代谢率较低, 更容易在体外条件下生存。目前, 鱼类细胞培养技术主要以哺乳动物为参考, 一般分为原代细胞培养和传代细胞培养。其中原代细胞培养是指在无菌、麻醉条件下从鱼体取出组织分离出单个细胞, 人工模拟机体内环境, 使其在体外生长发育, 经过一段时间培养, 长到一定密度后即可进行传代操作, 传代后的细胞就是细胞系[2]。原代培养最大的优点是细胞离体时间短, 生物学特性尚未发生明显改变, 为二倍体核型, 能够更加真实反映出体内的生长特性, 适合应用于毒性测试、免疫学等研究实验[51]。常用于分离单个细胞的方法有组织贴壁法、酶消化法和机械消化法, 产生的原代细胞用于后续传代培养。
3.1.1 组织块贴壁法 组织块贴壁法最早应用于Harrison蝌蚪脊索神经细胞培养, 组织细胞浸没于淋巴液中获得营养生长发育。该法适用于组织量较少或生长较致密的组织, 如鳍条、皮肤、肌肉和性腺等组织, 因为机械或酶解作用可能造成细胞损伤。而组织块贴壁法的不足之处在于部分组织缺乏粘附性, 向外迁移生长具有选择性。尽管如此, 组织块贴壁法仍是常见且简单可行的原代细胞培养方法之一。组织块贴壁法是在无菌条件下分离出目的组织, 用缓冲液清洗被膜、脂肪以及血液等杂质, 用无菌解剖工具将组织块分离成1 mm3大小, 接种在细胞瓶底部。加入培养基转移至培养箱中培养, 并根据细胞生长情况及时更换细胞培养液, 直至细胞从组织块周围迁出。组织块贴壁法需要较长时间才能使组织贴壁, 掌握好贴壁时间尤为重要, 可避免组织细胞缺少营养而死亡。
以往研究表明, 组织块贴壁法培养的细胞具有细胞形态完整、增殖能力强等优点。Githa等[52]对淡黑雀鲷(Pomacentrus caeruleus)的各部位组织细胞进行细胞培养条件探究, 结果发现, 用组织块贴壁法对不同组织原代细胞培养, 只有鳃、胸鳍和尾鳍组织细胞获得良好的融合细胞单层。利用组织块培养大进行团头鲂骨组织细胞系(MBCs)的建立, 可大量培养出以辐射状的形式生长稳定的贴壁细胞[53]。
3.1.2 酶消化法 利用酶消化法可以避免细胞因迁移率而选择性生长的问题, 在短时间内能够快速获得大量具有代表性的细胞, 适用于培养大量组织。酶消化法是指将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维)去除, 细胞分散成细胞悬液, 使细胞更易汲取外界养分并排除代谢废物。用于体外分离细胞的蛋白消化酶主要有胰蛋白酶(trypsin)、胶原酶(collagenase)、溶菌酶(lysozyme)、胃蛋白酶(pepsin)、中性蛋白酶(Sarre peptidase)等, 细胞消化过程中胰蛋白酶和胶原酶较为常见。例如, 大口黑鲈(Micropterus salmoides)性腺细胞系(LMBG)建立时将组织悬浮在0.25% 的胰蛋白酶进行消化, 所分离出的单细胞生长状态佳并传代超过118代[54]; 利用同样的方法, Gao等[55]建立了大菱鲆(Scophthalmus maximus)肌肉连续成纤维样细胞系(TMF), 后续的传代培养成功培养超过60多代。另有研究运用不完全消化法进行原代细胞培养, 即采用组织块贴壁法和酶消化法结合, 既可提高细胞产率又可保持细胞间的相互联系[56-57]。
3.1.3 机械破碎法 采用组织贴壁法培养原代细胞时, 细胞迁出速度较慢, 仅适用于少量组织, 而利用酶消化法对细胞消化过程中存在损害细胞的风险, 因此机械破碎法也受到了许多研究人员的青睐。机械破碎法适用于电解质较软、内含纤维性成分较少且对机械分离具有耐受性的组织, 如胚胎、脾、肝、成年鱼体的脑或软质肿瘤等。通常机械破碎法是指通过各种物理手段将组织块破碎分离成单个细胞, 常利用尼龙网、不锈钢网研磨过滤或反复吹打组织, 离心重悬得到单细胞悬液, 这种方法可较快地获取大量细胞, 但是易产生机械损伤。如草鱼肠道上皮细胞(IECs)的培养采用不同的消化方法, 经对比检验可知, 采用机械破碎法进行消化分离出的细胞效果较好, 但是该方法在分离单细胞的同时易产生机械损伤[58]。
以上培养方法中, 细胞需要依赖于锚定的固体基质来附着、扩散和生长, 同时细胞培养需要提供营养的培养基和所需的生长因子作为细胞生长补充剂。
3.2 细胞培养条件3.2.1 细胞培养基 早期细胞培养多采用天然培养液, 一般为组织提取物和体液, 常见的有淋巴液、血浆、血清。随着随着细胞培养的深入研究, 细胞培养液的化学成分逐渐明确。Eagle等成功研制的合成培养基进一步推动了细胞培养的研究进程。Eagle's基础培养基成分简单, 仅含有必需氨基酸、维生素和无机盐[59-62]。后来根据不同细胞的特性设计了成分更加多样化的培养基, 如DMEM培养基是为了小鼠成纤维细胞而设计。迄今为止用于鱼类细胞的特殊培养基种类有限, 主要参考已建立细胞系的培养程序进行。根据研究数据显示, DMEM、M199、F12、L15以及DMEM/F12近年来被广泛应用[63-65]。
3.2.2 血清 除了基础培养基外, 血清是鱼类细胞培养基中重要的补充剂之一, 含有多种生物活性物质[66]。常用于细胞培养的血清主要有胎牛血清、小牛血清、成年马血清及本体血清(如鱼血清), 其中胎牛血清和小牛血清应用最为广泛, 尤其是胎牛血清的培养效果最佳。胎牛血清为怀孕5~8个月的母牛胎盘中未发育完全的胎牛血清。胎牛血清未曾接触过外界, 含有抗体、补体等对细胞有害成分少, 并含有特殊的生长因子, 有利于细胞的贴壁和铺展, 同时提供载体蛋白以中和毒性物质减少细胞损伤, 提供蛋白抑制剂以保护细胞免受凋亡细胞释放的蛋白酶损害。鱼类细胞培养过程中也可添加一定量的本体血清作为促生长剂, 如尼罗罗非鱼胚胎干细胞原代培养时, 培养液中添加罗非鱼血清, 研究发现本体血清具有促进胚胎干细胞分裂的作用[67]。
根据培养细胞不同, 培养基中含有的血清量有所差异, 原代细胞培养时, 对营养成分需求量较大。如Liu等[59]在石斑鱼脑细胞原代培养研究过程中发现, 采用培养液中含有15% 和20% FBS培养的细胞生长率显著高于FBS含量为5% 和10% 的培养液, 而15% 和20% FBS培养液间无显著差异。眼斑双锯鱼(Amphiprion ocellaris) 尾鳍细胞系(OCF)在5%、10% FBS条件下生长状态较差, 而在15% FBS条件下生长相对较好, 而20% FBS条件下细胞生长状态最佳, 随着传代次数的增加至34次时可将FBS浓度逐渐降至15%[68]。另有研究发现, 大黄鱼(Larimichthys crocea)性腺细胞采用20% FBS进行培养效果较好[69]。
3.2.3 生长因子和抗生素 细胞培养液除了基础培养基和血清外, 还可添加少量生长因子以促进细胞生长增殖。常用的生长因子主要有表皮细胞生长因子(EGF)和成纤维生长因子(FGFs)。EGF是动物体内一种重要的细胞因子, 对形成细胞、成纤维细胞核癌前病变细胞等具有促进作用[70]。而FGFs则可协同神经营养因子, 具有较强的促有丝分裂活性作用, 促进感觉神经和神经系统的生长[71-72]。例如, 碱性成纤维生长因子(bFGF)被用于刺激斑马鱼和牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎细胞的增殖[73-74]; 蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus) 细胞系(SBR-E1) 在传代培养1~12代的培养液中加入bFGF, 一定程度上可抑制细胞分化[75]; 在金鱼和银鲫(Caras sius auratus gibelio)脑细胞系建立过程中被证明EGF和bFGF可用作脑细胞前10代增殖的有效促有丝分裂因子[18]。另外, 浓度不同的生长因子对细胞增殖的促进作用不同, 低浓度时随生长因子浓度增加而增加, 达到峰值后浓度上升甚至会发生抑制细胞生长的现象。
细胞对微生物的防御能力较弱, 培养基中含有丰富的营养物质为微生物提供了游离的生长环境, 快速增殖的微生物分泌的毒素易导致细胞大量死亡, 在细胞培养初期为防止微生物污染, 通常会向培养液中添加适量抗生素。常用于组织培养的抗生素有青霉素、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素等。尽管如此, 在研究过程中发现用于组织培养的抗生素对于控制细菌污染有一定效果, 但依然存在许多菌株产生抗药性, 因此抗生素的选择和应用上需要谨慎处理[52, 76]。
3.2.4 pH和温度 在确保细胞充足的营养来源和防止污染微生物外, 适宜的pH和温度对于细胞生长同样至关重要。细胞培养环境pH值一般保持在7.0~7.4, 培养基pH值过高或过低都会影响细胞的生长增殖。将其放置在含有5%CO2培养箱中可一定程度上维持pH值稳定。L15培养基配方中不含碳酸氢钠缓冲系统, 不需要CO2平衡环境, 因此受到许多研究人员青睐, 广泛应用于鱼类细胞的培养[77]。
细胞培养温度与其生存的环境温度紧密相关, 鱼类属于变温动物, 因此鱼类细胞培养的温度范围比哺乳动物更加广。根据Fryecr等[22]的观点, 冷水性鱼类细胞培养的适温范围为4~24℃, 最适温度为15~21℃; 温水性鱼类的适温范围为15~37℃, 最适温度为25~35℃。例如, 虹鳟肾脏和眼睛细胞系低温下生长良好, 8~20℃细胞达到较好的生长状态, 16℃下生长最快, 2~3 d内即可形成单层细胞; 罗非鱼肝细胞系在28℃和37℃条件下生长良好, 可存活2~3周, 39℃高温下也可存活5~7 d, 这证明了罗非鱼肝细胞的相对耐高温性[78]。即使同一种物种不同细胞的体外培养温度和适应性也具有特异性, 罗非鱼肾脏细胞系(TiK) 在15℃时细胞增长缓慢, 而在34 ℃时细胞生长速率在前2 d较为迅速, 随后变慢趋于稳定, 速率约为最适温度28℃的50%[79]。研究发现, 在培养条件优化过程中提高了大黄鱼卵巢细胞系(LYCO)和大黄鱼睾丸细胞系(LYCT) 在27℃时的生长速度和增殖能力[80]。
4 鱼类细胞培养展望鱼类细胞系大多从重要经济鱼类中建立, 细胞体外培养可以很好地保留组织内的同质性, 获得并维持细胞在体内外的增殖, 而硬骨鱼体内免疫刺激后各种免疫基因表达水平快速反应已被多方证实, 但是对于诱导的免疫机制尚不明确, 因此建立新鱼类细胞系在后期水产动物研究中发挥着重要作用[81]。
工农业的迅速发展以及人们生活水平的提高产生了大量化学、重金属等污染物, 由于其在水中不易降解, 这些污染物如何影响水生动物的健康生长促使我们更多地关注鱼类细胞的反应机制。在哺乳动物中, 小鼠多功能干细胞(iPSC) 具有无限的增殖能力, 被用于研究高等动物多功能的模型, 而鱼类iPSC的研究较少, 鱼类多功能干细胞也可作为潜在的低等脊椎动物多功能机制的重要模型, 以满足日益增长的水产养殖需求[82-83]。不仅如此, 鱼类iPSC也可作用于再生医学、疾病建模、基于iPSC的药物发现以及毒性评估等, 因此对于鱼类iPSC的深入研究非常必要。目前已建立了家畜生物库, 除了胚胎细胞外, 许多体细胞也可用于日后的生产或克隆动物, 建立一个类似的鱼类细胞生物库, 保存有价值的濒危鱼类, 从长远来看是一种有效、经济、方便并且值得大力推广的鱼类濒危物种保护手段[84]。
一直以来, 最常见的细胞培养方法是二维(2D)细胞培养方法, 然而由于2D细胞培养法具有一定的局限性, 比如2D细胞培养条件下细胞不能模拟组织或肿瘤的自然结构[85]。而三维(3D)细胞培养具有通过类器官的方式来代替器官的潜力, 有望能弥补2D细胞培养的缺陷, 尽管目前3D细胞培养还存在着难以还原细胞微环境等问题[86-87]。因此, 未来实现鱼类细胞分离技术和细胞培养条件的标准化, 对于鱼类细胞的应用尤为重要。鱼类细胞的研究虽晚于哺乳动物, 但发展十分迅速, 据统计现有1 128株鱼类细胞从不同组织中被建立, 仍有许多鱼类细胞有待进一步深入研究。细胞培养技术早已渗透至生命科学的各个学科, 有着广阔的发展前景。
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(责任编辑 崔建勋)