2022, Vol. 49文章信息
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基金项目
- 国家重点研发计划项目(2019YFC1712305)；广西自然科学基金(桂科AD212200832020)；2020年广西高等学校千名中青年骨干教师培育计划项目
作者简介
- 姚绍嫦(1980—), 女, 博士, 研究员, 研究方向为药用植物繁育与栽培, E-mail: yaoshaochang@163.com.
通讯作者
- 黄荣韶(1964—), 男, 博士, 教授, 研究方向为药用植物繁育与栽培, E-mail: hrshao802@163.com.
文章历史
- 收稿日期：2022-02-24
2. 桂林亦元生现代生物技术有限公司，广西 桂林 541004
2. Guilin Yiyuansheng Modern Biotechnology Co., Ltd, Guilin 541004, China
【研究意义】积雪草为伞形科积雪草属植物积雪草[Centella asiatica (L.) Urban]的干燥全草，别名雷公根、崩大碗，分布于我国广东、广西、四川、云南、陕西、福建、台湾等省区和印度、斯里兰卡、马来西亚、印度尼西亚、大洋洲群岛、日本、澳大利亚及中非、南非等国家[1]。积雪草始载于《神农本草经》，是历年版《中华人民共和国药典》收载的常用中药材，也被《广西壮族自治区壮药质量标准》(第一卷，2008版)收载[2]，是广西常见的壮瑶药材。积雪草味苦、辛，性寒，具有清热利湿、解毒消肿的功效，用于治疗湿热黄疸、中暑腹泻、石淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤等[3]。已有研究表明，积雪草具有促进伤口愈合、修复皮肤瘢痕、抗过敏、抑制黑色素、抗氧化、抗胃溃疡及防治心血管疾病等药理作用，被广泛用于医药、美容保健等行业[4-7]，具有较好的经济价值与市场前景。积雪草的应用形式多样，其干燥叶片可作为茶饮，新鲜叶片常被用作蔬菜、沙拉或榨汁直接饮用[8]。由于临床疗效明确、资源分布广泛，目前积雪草已被纳入多个国家的药典，如中国药典[3]、美国药典[9]、欧洲药典[10]、波兰药典[11]等。据不完全统计，积雪草药材的年需求量已超过9 000 t, 2020年的统货价为14元/kg，高含量(总苷质量分数 > 3%)的积雪草药材价格甚至高达30元/kg以上且供不应求。随着全球化妆品市场的飞速发展，在护肤品与化妆品的生产上使用绿色环保、天然植物成分是美妆行业的必然发展趋势，而积雪草目前已成为法国欧莱雅复颜积雪草修护微精华露、上海百雀羚积雪草舒润修护精华水等几十种美容化妆品的核心原料。因此，开展积雪草的人工栽培技术研究，生产高产优质的药材供应市场需求迫在眉睫。【前人研究进展】中药材生产过程的主要栽培技术措施是影响中药生产与品质形成的重要因素，适宜的种植密度能增加植株叶片光合速率及光合产物的积累，既可保障药材品质优良又可提高经济效益[12-13]。目前，关于积雪草的人工栽培技术已有少量报道，但这些技术仅涉及种质资源评价、农艺性状对比、种苗繁育技术等方面。张小刚[14]结合化学多样性和遗传多样性对积雪草种内变异和品质评价进行研究，可为积雪草优良种质的遴选和GAP基地的建立提供科学依据。以带芽的匍匐茎为外植体，积雪草的组培快繁技术得到了突破[15-16]。对积雪草的人工种植，刘曲山等[17]以盆栽方式考察了土壤类型、种植密度、基肥、施肥方式及荫蔽度等不同因素对种植效果的影响，但研究结果对于指导大面积推广种植具有一定的局限性。【本研究切入点】广西是积雪草的道地产区之一，具有开展人工种植的适宜环境条件，但目前对于不同种植密度对积雪草光合特性、产量与品质的影响尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用单因素完全随机区组试验设计的方法，考察在大棚种植方式下不同种植密度对积雪草叶片光合特性、产量和品质的影响，以期为积雪草的人工种植田间技术优化提供科学的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试积雪草来源于广西中医药大学药学院中药资源研究团队与桂林亦元生现代生物技术有限公司合作共建的积雪草人工种植及育苗基地，经广西中医药大学谭勇教授鉴定为伞形科积雪草属积雪草〔Centella asiatica (L.) Urban〕。
仪器：电子天平(YP502N，上海菁华仪器有限公司)，台称(TC10KB，江苏双杰仪器有限公司)，日本岛津高效液相色谱仪LC40(带自动进样器)，德国海道夫Hei-VAP Core HL小型旋转蒸发仪，便携式光合测定系统Li-6400(Li-Cor Inc., Lincoln, USA)，紫外分光光度计(WD-9403B，北京六一生物科技有限公司)。
试剂：甲醇、乙腈(Fisher，色谱纯)，β-环糊精(批号7585-39-9，纯度≥98%)、对照品积雪草苷(批号16830-15-2，纯度≥98%)、羟基积雪草苷(批号34540-22-2，纯度≥98%)均购自中国食品药品检定研究所。其他试剂均为分析纯。
1.2 试验方法试验地设在广西壮族自治区南宁市宾阳县武陵镇沙井村(23°16'06.90"N, 108°86'20.38"E)，海拔119.2 m，年均温度21.0℃，无霜期360.5 d，南亚热带气候区，土壤以砂页岩赤红壤、石灰岩亦红壤为主，地势平整开阔，宜种性广。
试验采用单因素完全随机区组设计，在大棚种植条件下，积雪草种植密度设置3万、6万、12万、16万、25万株/hm2 5个水平，，小区面积24 m2(1.2 m×20 m), 3次重复，共30个小区，试验地周围设保护行。2020年11月，对积雪草进行扦插育苗。2021年4月上旬，种植前犁耙土块细碎，起畦宽120 cm、高20 cm，整平畦面，施用微生物有机肥3 000 kg/hm2与畦面土壤混匀。采用圆木桩+竹竿搭建简易大棚，圆木桩在大棚四周及内部主要的受力点垂直牢固扎于地面，竹竿在棚顶平行于地面搭建成棚架，用绳子捆绑固定；棚高1.8 m，棚顶用遮光度30%的遮阳网覆盖，棚四周垂下1.0 m遮阳网作帘子。2021年4月15日定植，定植后统一进行常规田间管理。
1.3 测定指标及方法1.3.1 植株叶片形态 于2021年6月中旬，每个小区随机挑选旺盛生长期的10株积雪草统计植株的分枝数，并随机挑选10片完整、生长旺盛、无病虫害的叶片进行形态指标测定。用游标卡尺测量植株茎粗、叶片厚度；用直尺量取每张叶片的长度、宽度和叶柄长度；用天平称量植株的单株鲜质量，然后以50℃恒温烘箱烘干至恒重后称量单株干质量。重复3次。
1.3.2 叶片光合参数 于2021年6月中旬晴朗无云天气的上午10:00~11:00，每个小区随机挑选旺盛生长期的5株积雪草进行叶片光合参数测定。测定前先将仪器设定好估测的饱和光强800μmol/(m2·s)，并对被测叶片进行光诱导30 min，每个植株选取完整、健康、成熟的向阳叶片3片进行测定，待仪器的净光合速率(Pn)参数的变化幅度小于0.1时开始记录数据，记录净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)和气孔导度(Gs)等主要光合参数，重复3次。
1.3.3 叶绿素含量 积雪草叶片的叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总含量采用丙酮乙醇混合溶液法测定。将新鲜叶片剪成细丝状后，准确称量2 g，放入50 mL容量瓶中，加入丙酮乙醇混合液定容，在黑暗的室温条件下抽提12 h，取上清提取液备用。用分光光度计测定不同样品分别于663 nm和645 nm波长下的光密度值(OD值)，计算叶绿素含量(mg/g):
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式中，V为提取液体积(mL), W为叶片鲜质量。
1.3.4 产量 2021年8月15日，每个小区随机挑选1 m2收获积雪草的地上部分，测量鲜质量，然后在50℃恒温烘箱烘干至恒重后称量干质量，折算每公顷积雪草鲜质量、干质量以及折干率。
1.3.5 植株主要成分质量分数 采用高效液相色谱法测定积雪草苷、羟基积雪草苷的质量分数。
供试品溶液制备：参照《中华人民共和国药典》(2020年版)[3]的方法。将干燥后的积雪草样品粉碎过四号筛(孔径0.25 mm)，取粉末约1 g，精密称定，置于50 mL圆底离心管中，加入80%甲醇25 mL，密塞、称重，浸泡1 h后，超声提取30 min，放冷后再称重，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，10 000 r/min离心5 min，取上清液，用0.22µm滤膜过滤即得供试液。
对照品溶液制备：分别取积雪草苷、羟基积雪草苷对照品适量，精密称重，加甲醇制成2 mg/mL溶液，得到2种对照品储备液；稀释配制质量浓度依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的工作溶液，分别进样10μL。以对照品溶液的进样量为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制对照品标准工作曲线。积雪草苷的回归方程为y=3278.84x (r=0.9999)，羟基积雪草苷的回归方程为y=3304.40x (r=0.9999)。积雪草总苷质量分数为同样品中的积雪草苷质量分数与羟基积雪草苷质量分数之和。
1.4 数据处理试验数据采用Excel和SPSS 24.0软件进行统计分析与作图，并进行正态检验和方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较。
2 结果与分析 2.1 不同种植密度对积雪草叶片形态指标的影响由图 1可知，种植2个月时，积雪草正处于旺盛生长期，密度6万~25万株/hm2积雪草已逐渐覆盖满畦面。除密度25万株/hm2的积雪草单株鲜质量显著低于其他密度外，分枝数、单株干质量、茎粗、叶片厚度、叶柄长、叶长、叶宽等形态指标在不同种植密度下均无显著差异(表 1)。
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| 图 1 不同种植密度的积雪草生长情况 Fig. 1 Growing states of Centella asiatica under different planting densities |
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2.2 不同种植密度对积雪草光合特性的影响
2.2.1 净光合速率(Pn) 由图 2可知，不同种植密度对积雪草叶片的净光合速率影响较大。随着种植密度的提高，积雪草叶片的净光合速率(Pn)呈先升高后降低的变化趋势，以12万株/hm2的净光合速率最大、为15.24μmol CO2/(m2·s)，而3万株/hm2的净光合速率最小、为12.81μmol CO2/(m2·s); 12万株/hm2的Pn显著高于3万、16万、25万株/hm2，但6万与12万株/hm2密度两者之间差异不显著。表明积雪草叶片的Pn在低密度时随种植密度的增加而增加，但高密度时随种植密度的增加而降低，6万~12万株/hm2的种植密度更有利于积雪草叶片净光合速率的增加。
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| 小写英文字母不同者表示差异显著 Different lowercase letters represent significant differences 图 2 不同种植密度对积雪草净光合速率的影响 Fig. 2 Effects of different planting densities on net photosynthetic rate of Centella asiatica |
2.2.2 气孔导度(Gs) 气孔导度的增加有利于CO2进入植物体内进行气体交换，为光合作用提供充足原料，从而提高光合作用效率。由图 3可知，随着种植密度的增加，积雪草叶片的Gs呈先升高后降低的变化趋势，其中6万株/hm2的Gs显著高于其他密度，达0.59 mmol/(m2·s)，表明6万株/hm2更适合积雪草叶片气体交换，光合作用效率更高；在3万株/hm2，积雪草叶片Gs最小、为0.40 mmol/(m2·s)，表明种植密度过小也会造成叶片Gs迅速下降。
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| 小写英文字母不同者表示差异显著 Different lowercase letters represent significant differences 图 3 不同种植密度对积雪草气孔导度的影响 Fig. 3 Effects of different planting densities on stomatal conductance of Centella asiatica |
2.2.3 胞间CO2浓度(Ci) 由图 4可知，3万、12万、16万、25万株/hm2密度的Ci值均较小，且处理间差异不显著；6万株/hm2的Ci值为349.61μmol/L，显著高于其他密度处理，比12万株/hm2的Ci值(323.79μmol/L)提高7.97%。表明适宜种植密度有利于提高Ci值，在种植密度为6万株/hm2时，积雪草的Ci值显著高于其他密度。
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| 小写英文字母不同者表示差异显著 Different lowercase letters represent significant differences 图 4 不同种植密度对积雪草胞间CO2浓度的影响 Fig. 4 Effects of different planting densities on the concentration of intercellular CO2 in Centella asiatica |
2.2.4 蒸腾速率(Tr) 类似于Pn, Tr也呈先升高后降低的变化规律，在6万株/hm2时获得最大值，为3.08μmol/(m2·s)，显著高于其他密度(图 5)，比3万株/hm2提高44.97%。因此，我们认为积雪草在密度6万株/hm2下生长更容易获得较高的叶片蒸腾速率。
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| 小写英文字母不同者表示差异显著 Different lowercase letters represent significant differences 图 5 不同种植密度对积雪草蒸腾速率的影响 Fig. 5 Effects of different planting densities on transpiration rate of Centella asiatica |
2.3 不同种植密度对积雪草叶绿素含量的影响
类似于Pn与Tr，积雪草叶片的叶绿素含量，包括叶绿素a、叶绿素b与叶绿素总量随着种植密度的增加而呈先上升后下降的变化规律。由图 6可知，在低密度下，适当增加种植密度可显著提高叶绿素a含量，与种植密度最小的3万株/hm2相比，6万株/hm2的叶绿素a含量为3.74 mg/g，增加17.63%；种植密度最大的25万株/hm2叶绿素a含量反而最小、仅为2.76 mg/g，显著低于其他密度，表明密度过高也不利于叶绿素a的生成。叶绿素b含量也在6万株/hm2下最高，达1.64mg/g，显著高于其他密度。类似于叶绿素a与叶绿素b含量的变化趋势，叶绿素总量(5.38 mg/g)在6万株/hm2下也显著高于其他密度，比25万株/hm2的叶绿素总量(4.01 mg/g)提高34.17%。不同种植密度的叶绿素a/b比值范围为2.12~2.52，均低于3，表明积雪草属于耐阴药用植物。
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| 小写英文字母不同者表示差异显著 Different lowercase letters represent significant differences 图 6 不同种植密度对积雪草叶绿素含量的影响 Fig. 6 Effects of different planting densities on chlorophyll content in Centella asiatica |
2.4 不同种植密度对积雪草产量的影响
由表 2可知，积雪草产量在不同种植密度下差别较大，其中6万株/hm2获得最高的单位面积鲜质量2.14 kg/m2、公顷鲜质量21.44 t/hm2、公顷干质量4.20 t/hm2，均显著高于其他密度，与3万株/hm2相比，6万株/hm2的单位面积鲜质量、公顷鲜质量与公顷干质量分别高75.41%、75.59%和77.22%；从折干率来看，6万株/hm2的折干率最高、为19.60%，而折干率最低的为6万株/hm2、仅16.52%, 6万株/hm2的折干率比25万株/hm2高3.08个百分点，差异显著。因此，我们认为在积雪草的人工栽培过程中6万株/hm2能够实现更高的产量。
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2.5 不同种植密度对积雪草品质的影响
由图 7可知，不同种植密度积雪草的积雪草苷与羟基积雪草苷总质量分数为1.95%~2.73%，均远高于药典标准，且积雪草苷的质量分数均高于羟基积雪草苷的质量分数。随着种植密度的增加，积雪草苷与羟基积雪草苷的质量分数均呈先缓慢上升再下降的变化趋势，其中6万株/hm2下积雪草苷、羟基积雪草苷的质量分数最高，分别为1.55%和1.18%，但与3万株/hm2无显著差异；25万株/hm2密度下积雪草苷与羟基积雪草苷的质量分数最小，显著低于其他密度。我们用总苷的质量分数来表示积雪草苷的质量分数与羟基积雪草苷的质量分数之和，结果发现不同种植密度的积雪草总苷质量分数从高到低依次为6万、3万、12万、16万、25万株/hm2，且3万株/hm2与6万株/hm2、12万株/hm2与16万株/hm2间均无显著差异。
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| 小写英文字母不同者表示差异显著 Different lowercase letters represent significant differences 图 7 不同种植密度对积雪草主要成分的影响 Fig. 7 Effects of different planting densities on main compositions in Centella asiatica |
2.6 积雪草光合特性与产量、品质的相关性分析
从表 3可以看出，蒸腾速率(Tr)与积雪草鲜质量(FW)呈显著正相关，而积雪草干质量(DW)与Pn、Tr、Ci、Gs等主要光合参数均呈正相关关系，且与Tr、Gs的相关性达显著水平；积雪草干质量(DW)还与叶绿素总量(Chl)呈显著正相关，表明光合特性越强，叶绿素含量越高，光合效率越强，药材产量越高。虽然积雪草苷(As.)的质量分数与羟基积雪草苷(Ma.)的质量分数之间呈极显著正相关，但它们与光合特性、叶绿素总量、产量等指标的相关性较小，均不显著。
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3 讨论 3.1 适宜种植密度能有效提高积雪草叶片的叶绿素含量
光合作用是植物体内重要的代谢过程，叶片是进行光合作用最主要的器官。在叶片叶肉细胞中，含有进行光合作用的主要色素——叶绿素，其含量直接影响叶片光合效率[19]。测量叶绿素含量的方法有分光光度法、叶绿素仪法、原子吸收光谱法等，其中分光光度法的应用最广泛[20]。本研究中，我们利用分光光度法测定不同种植密度对积雪草叶片叶绿素含量的影响，发现叶绿素a、叶绿素b与叶绿素总量均在6万株/hm2达到最高，表明此时光合能力较强。陈雷等[21]、王雪莱等[22]分别在花生与裸燕麦上证实随着种植密度的增加叶绿素含量呈下降趋势。陈康等[23]研究表明，种植密度20万株/hm2的花生成熟期叶绿素含量分别比12万、28万株/hm2密度高3.70%~27.82%和6.10%~18.94%，差异均达显著水平。本研究也得到类似的结果，6万株/hm2的积雪草叶片叶绿素含量最高，在一定范围内(6万~25万株/hm2)随着种植密度的增加，积雪草叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量均呈下降趋势，且下降幅度随着密度的增加而增大，表明密度过大不利于积雪草叶片保持较高叶绿素含量，会降低其光合效率。叶绿素含量在3万株/hm2密度下较低，可能是由于积雪草植株在密度过小时无法形成合理冠层结构所致。关于叶绿素a/b比值，有学者认为阴生植物叶片的叶绿素a/b小于3[24]，且遮阴条件能使其叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素a/b比值增加[25]。本研究发现积雪草在遮阴条件不同密度下的叶绿素a/b比值范围为2.12~2.52，均低于3，这一结果为证明积雪草是适宜阴生环境的植物提供了依据，同时也提示在人工栽培生产中进行适当遮阴处理有利于积雪草植株生长。
3.2 适宜种植密度能有效提高积雪草叶片的光合特性净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)和气孔导度(Gs)等主要光合参数可作为判断植物光合作用强弱的指标[26]。Pn直接反映植物光合能力，维持较高的净光合速率是作物获得高产的基础。有研究表明，随着种植密度的增加，裸燕麦[22]、芝麻[27]、桔梗[13]的Pn均逐渐降低。不同于前人研究，本研究从低密度(3万株/hm2)到中密度(12万株/hm2)时Pn逐渐升高，但从中密度(12万株/hm2)到高密度(25万株/hm2)时Pn逐渐降低；Tr、Ci、Gs等主要光合参数也呈现出随种植密度增加而呈先升高后降低的趋势，其原因可能在于低密度下植株的冠层结构及冠层内光分布较合理，Ci和Gs均保持在较高水平，使得冠层内光合特性得到提高；而在过高密度条件下，冠层内通风透光不良，从而削弱了中下部叶片的光照条件，导致光合生产率下降。
3.3 适宜种植密度能有效提高积雪草药材的产量和有效成分含量作物生长常受遗传特性、种植区域与栽培管理措施等多种因素综合影响。合理密植有利于构建优良群体结构，缓解群体与个体之间高作物群体光能利用率，进而增加作物产量[18]。因此，为使积雪草获得较高产量，应选择适宜的种植密度。本研究中，积雪草的鲜质量与干质量均随种植密度的增加呈先升高后降低的变化趋势，均在6万株/hm2时达到最大值，表明当种植密度为6万株/hm2时，积雪草群体结构合理，群体光能利用率较高。相关性分析结果显示，Tr与积雪草的鲜质量之间呈显著正相关关系，而积雪草干质量则与Tr、Gs等主要光合参数以及叶绿素总量均呈显著正相关，表明产量与光合特性之间具有较强相关性。因此，在本研究中，积雪草在低密度下的光合同化能力表现出明显优势，单位面积生物量较高，但倘若群体相对较小(如3万株/hm2)，仍未能得到较高产量；在过高密度下，积雪草单株的光合同化能力会明显受到限制，单位面积生物量较低，最终也会导致产量下降。这与刘凯强等[28]在燕麦上的研究结果相一致。
对药用植物，除要求一定产量外，更注重药材质量。药用植物的有效成分是其发挥临床疗效的物质基础，也是评价药材质量的重要指标，而这些有效成分的质量分数通常与栽培技术密切相关[29]。刘超等[30]研究发现，不同种植密度对红花的红花黄色素含量有一定影响，种植密度过大，红花黄色素减少，当种植密度减小到一定程度时，其质量分数基本保持不变。本研究也得到类似结果，在种植密度3万~6万株/hm2范围内，积雪草苷与羟基积雪草苷质量分数差异较小，而在种植密度12万~25万株/hm2时积雪草苷与羟基积雪草苷质量分数逐渐减小。根据《中华人民共和国药典》(2020年版)的规定，积雪草干燥药材的积雪草苷(C48H78O19)和羟基积雪草苷(C48H78O20)的总量不得少于0.80%。本研究中，积雪草不同种植密度的积雪草苷与羟基积雪草苷总量范围为1.95%~2.73%，均远超《中国药典》2020年版的规定。随着种植密度的增加，积雪草苷与羟基积雪草苷的质量分数均呈先缓慢上升再下降的变化趋势，以6万株/hm2的积雪草苷与羟基积雪草苷质量分数总和最高、为2.73%。可见，6万株/hm2的种植密度能使积雪草达到药材高产、优质的效果，是积雪草人工栽培的适宜密度。
4 结论本研究结果表明，虽然积雪草的分枝数、单株干质量、茎粗、叶片厚度、叶柄长、叶长与叶宽等形态指标在不同种植密度下均无显著差异，但种植密度对叶片的叶绿素含量、光合特性、药材产量与品质均具有显著影响。随着种植密度的增加，积雪草叶片的叶绿素含量、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)、产量及主要成分质量分数均呈先升高后降低的变化趋势。当种植密度为6万株/hm2时，积雪草叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量、Gs、Ci、Tr均达到最大值，显著高于其他密度，表明6万株/hm2能有效增强积雪草的光合特性、促进叶绿素积累、增加光合效率；药材的鲜质量、干质量、折干率在6万株/hm2的密度下分别达到21.44、4.20 t/hm2、19.60%，均显著高于其他密度，表明在此密度下更有利于光合产物的积累从而提高产量。在该密度下，积雪草苷与羟基积雪草苷的质量分数最高、达到2.73%，远超《中国药典》2020年版规定(0.8%)。因此，我们认为6万株/hm2是积雪草大棚栽培最适宜的种植密度，能有效增强积雪草光合特性、增加光合效率，进而提高药材的产量与品质。
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(责任编辑 邹移光)