【研究意义】黄喉拟水龟（Mauremys mutica）属地龟科（Geoemydidae）拟水龟属（Mauremys），具有较高的食用、药用和观赏价值，从20世纪80年代以来已成为我国重要的养殖龟类。随着人们生活水平的提高以及对高质量食品蛋白需求的增加，黄喉拟水龟的养殖受到广泛关注，已成为广东、广西及海南等南方地区重要的龟类养殖品种^[1]。但随着养殖规模不断扩大和养殖环境恶化，由肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）引起的白眼病和肺炎时有发生^[2-3]。肺炎克雷伯菌通常分布于土壤和水生环境中，可感染人和动物，引起肺炎、肠炎、肝脓肿、脑膜炎及败血症等呼吸道和消化道疾病^[4-5]。可见，肺炎克雷伯菌可对黄喉拟水龟养殖业造成严重的经济损失，而且存在传染给人的风险^[6]。生产中常用抗菌药物和抗生素治疗黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌病，但易产生耐药菌株或药物残留，引起肉龟食用安全等问题^[7-9]。注射疫苗是防控动物疫病的有效手段^[10-11]。开展肺炎克雷伯菌外膜蛋白A的原核表达与纯化，可为黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌病的疫苗研发奠定基础。

【前人研究进展】目前针对肺炎克雷伯菌的疫苗种类主要有灭活疫苗、多糖疫苗以及蛋白疫苗等，均具有优良的保护力^[5]。但灭活疫苗成分复杂，可能存在不良反应；荚膜多糖的血清型众多，制备的疫苗易出现无效保护。肺炎克雷伯菌表面的荚膜、脂多糖、菌毛蛋白、外膜蛋白（Outer membrane proteins, KpOmp）等具有一定的免疫原性，可用于疫苗研发^[5]。其外膜蛋白或菌毛蛋白在各菌株之间非常保守，具备广谱保护潜力，用于制备蛋白疫苗成分单一，副作用小。肺炎克雷伯菌外膜蛋白为该菌细胞膜的主要成分，主要包括KpOmpA、KpOmpK17、KpOmpK35、KpOmpK36和KpOmpK37等，参与物质转运、信号传导、粘附、增强毒力和阻碍抗菌药物进入等生理活动，在感染宿主和诱导免疫反应中起重要作用^[12-14]。其中，OmpA在肠杆菌科中高度保守，具有介导细菌对真核细胞的粘附和侵袭^[15-16]以及抵抗血清补体的杀伤能力^[17]。此外，KpOmpA作为病原相关分子模式（Pathogen-associated Molecular Patterns, PAMP），能被先天免疫系统识别从而清除肺炎克雷伯菌的感染^[18]。研究表明，KpOmpA可增强肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）多糖免疫原性，并保护小鼠抵御细菌的攻击^[19]。Kurupati等^[20]应用含有KpOmpA基因的DNA疫苗接种小鼠，可以诱导其产生抗体，并表现出良好的攻毒保护率。这些研究结果为应用KpOmpA作为疫苗的候选分子预防黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌病提供借鉴。【本研究切入点】目前肺炎克雷伯菌疫苗的研究主要针对哺乳动物与人类，而黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究缺乏，表达纯化KpOmpA对研发肺炎克雷伯菌疫苗具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌KpOmpA基因，构建重组质粒并诱导其表达，纯化获取重组蛋白KpOmpA，可为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌相关疫苗的研发提供依据。

1　材料与方法 1.1　试验材料

黄喉拟水龟源肺炎克雷伯菌GXNN1菌株、大肠杆菌TOP10、BL21(DE3) 感受态细胞及pET-32a表达载体由广西大学动物科学技术学院水产免疫病害实验室保存。限制性内切酶（EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ）和T4 DNA连接酶购自TaKaRa（宝日医生物技术有限公司）；PCR产物胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、蛋白分子量标准、SDS-PAGE凝胶制备试剂、Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱以及PVDF膜均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、苯甲磺酰氟（PMSF）、脱脂奶粉以及ECL超敏发光液均购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠抗His-tag单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1 KpOmpA基因扩增、序列分析与原核表达载体的构建　根据KpOmpA基因序列（NCBI登录号：KP728941.1），设计带酶切位点引物。上游引物（划线部分为EcoR Ⅰ酶切位点）：5'-CCGGAATTCATGAAAAAGACAGCTATCGC-3'，下游引物（划线部分为Xho Ⅰ酶切位点）：5'-CCGCTCGAGTTAAGCCGCCGGCTGAGTTA-3'。以黄喉拟水龟源肺炎克雷伯菌DNA作为模板扩增KpOmpA基因，PCR扩增程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35个循环, ；72 ℃ 10 min。PCR产物按照胶回收试剂盒说明书进行目的片段纯化并由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。应用SeqMan软件拼接测序序列，在线BLAST搜索同源氨基酸序列，运用MegAlign软件对氨基酸序列进行多重比对和同源性分析。

运用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ对pET-32a空载体和目的片段进行双酶切，将纯化后的双酶切产物用T4连接酶于16 ℃下连接8 h（目的片段︰载体的摩尔比为3 ︰ 1），连接产物转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，于37 ℃下摇床（220 r/min）震荡培养3 h后将菌液涂板于含氨苄的固体培养基，37 ℃培养14~16 h。挑选单克隆进行阳性检测，引物选用通用引物（T7、T7ter），将阳性克隆菌液进行扩大培养后抽提重组质粒pET-32a-KpOmpA，双酶切鉴定后送去生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.2 重组蛋白表达和可溶性鉴定　重组质粒pET-32a-KpOmpA转化至BL21(DE3) 感受态细胞中，挑选单克隆接种至含100 μg/mL氨苄的10 mL LB培养基中，37 ℃过夜培养。取过夜培养的菌液按照1 ︰ 100接种于含氨苄的10 mL LB培养基中，37 ℃振荡培养3 h。当菌液OD₆₀₀约为0.6时，取出1 mL作为对照，剩余菌液加入IPTG使终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导4 h后取1 mL菌液进行SDS-PAGE检测。

为确定重组蛋白的可溶性，取8 mL诱导后的菌液以10 000 g离心3 min收集菌体并称重。每克湿重菌体加入10 mL pH为8.0的细菌裂解液（50 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L PMSF、1 mg/mL溶菌酶、5 mmol/L EDTA）进行重悬，于冰上进行超声破碎细胞30 min（30 W，超声5 s，间歇8 s），4 ℃ 10 000 g离心收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。

1.2.3 重组蛋白纯化　为纯化KpOmpA重组蛋白，扩大培养转化后的BL21重组菌，诱导表达、收集菌体、超声破碎及收集沉淀（包涵体）方法见1.2.2。收集沉淀后，为了去除少量脂类、核酸和其他杂蛋白等，应用10 mL洗涤液A（50 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、2% Tween-20和2 mol/L尿素）洗涤沉淀，涡旋震荡，4 ℃ 9 000 g离心10 min，收集沉淀并重复操作3次；应用10 mL洗涤液B（50 mmol/L Tris HCl和500 mmol/L NaCl）洗涤沉淀，去除样品中的EDTA，4 ℃ 9 000 g离心10 min，收集沉淀并重复操作3次；加入10 mL结合缓冲液（20 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、1 mmol/L β-巯基乙醇和8 mol/L尿素），应用磁力搅拌器于4 ℃下溶解包涵体8 h。将上述液体以4 ℃ 10 000 g离心10 min后收集上清，上清流经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱，收集过柱液。分别用4 mL不同浓度（5、10、25、50 mmol/L）的咪唑溶液洗脱Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱，分别收集各过柱液，通过SDS-PAGE检测分析。

1.2.4 Western blot鉴定重组蛋白　纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，通过WIX迷你转印仪将样品转至经TBST漂洗的PVDF膜，室温下用5% 脱脂奶粉封闭2 h，加入小鼠抗His-tag单克隆抗体（1 ︰ 3 000），在4 ℃下孵育过夜。之后用TBST洗膜3次（8 min/次），再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体（1 ︰ 2 000），在室温下孵育1 h后再次用TBST洗膜3次（8 min/次），避光滴加8~10滴ECL超敏发光液于膜表面，用ImageQuant LAS 500成像仪拍照。

2　结果与分析 2.1　KpOmpA基因扩增、序列分析及原核表达质粒的构建与鉴定

KpOmpA的PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析，在1 000 bp附近出现电泳条带，与预期结果相符（图 1）。测序结果表明，该基因CDS序列大小为1 071 bp，推定编码356个氨基酸。将本研究的龟源KpOmpA与牛源KpOmpA（GenBank登录号：AKN20218.1）、人源KpOmpA（GenBank登录号：MCM5720863.1）的氨基酸序列进行多重比对（图 2），结果表明KpOmpA氨基酸序列高度保守，同源性分别为99.4% 和99.7%。

重组质粒pET-32a-KpOmpA经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，酶切产物电泳后出现两条电泳带（图 3）。DNA测序结果证实，pET-32a-KpOmpA包含KpOmpA基因，且基因序列和阅读框正确，表明重组质粒pET-32a-KpOmpA构建成功。

2.2　重组蛋白表达和可溶性鉴定

将构建好的质粒pET-32a-KpOmpA转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE检测发现，经诱导的样品在57 kD处出现明显条带，与预期结果相符。诱导后经超声破碎，对上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果显示，KpOmpA重组蛋白在沉淀中含量高，以包涵体的形式存在（图 4）。

2.3　重组蛋白纯化

目的蛋白在大肠杆菌BL21感受态细胞诱导表达后，利用Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱进行过柱，用不同浓度的咪唑洗脱缓冲液进行梯度洗脱，并将收集的样品进行SDS-PAGE检测。结果显示，用5、10 mmol/L咪唑洗脱缓冲液能洗脱大量杂蛋白并收集到较纯的重组蛋白KpOmpA（图 5）。

2.4　Western blot鉴定重组蛋白

纯化的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜进行Western blot鉴定。结果（图 6）显示，57 kD处有明显的条带，与重组蛋白的大小一致，证明重组蛋白成功表达。

3　讨论

肺炎克雷伯菌隶属于肠杆菌科（Enterobacteria-ceae）克雷伯菌属，是一种具有包膜、兼性厌氧等特性的革兰氏阴性菌^[21]，主要感染人和动物的消化道、呼吸道和泌尿生殖道等。近年来主要以抗生素防治该菌引起的疫病^[22]，然而抗生素的滥用导致肺炎克雷伯菌耐药性加强，该菌逐渐威胁黄喉拟水龟养殖业的安全生产^[23]。接种疫苗是控制疫病的有效措施，KpOmpA已被证实具有较好的免疫原性^[20]，且序列高度保守，可作为疫苗研制的候选靶标基因，因此本研究表达纯化KpOmpA蛋白为肺炎克雷伯菌疫苗制备提供参考。

3.1　原核表达系统

与真核表达系统比较，大肠杆菌原核表达系统具有背景清晰、操作便捷和成本低廉等优点^[24-25]，因此被广泛用于蛋白表达。pET系统为大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白最强大的系统之一，最初由Dubendorff等^[26]利用该系统表达外源基因，随后许多研究也使用其表达外源目的基因^[27-28]。pET-32a表达载体除具有pET系列高效表达重组蛋白的特性外，还具备His-Tag，便于重组蛋白的检测与纯化。本研究成功构建pET-32a-KpOmpA表达质粒，并转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经IPTG诱导，重组蛋白KpOmpA高效表达，表明pET-32a适合表达KpOmpA。研究表明，用pET系列表达的重组蛋白免疫哺乳类^[28]、鱼类^[29]以及禽类^[30]，均表现出良好的免疫保护力，这些研究结果验证了pET系统可用于疫苗研制。

3.2　重组蛋白KpOmpA的存在形式

重组蛋白在37℃、IPTG诱导的条件下高效表达，产物大量堆积，蛋白质因未能进行正确折叠与二硫键配对而形成包涵体沉淀^[31]。包涵体为稳定的蛋白质聚集体，具有高密度、高纯度和蛋白不易降解的优点，但也存在一些局限性，如折叠错误、不具备生物活性、复性程序较复杂等。包涵体中的重组蛋白含量一般为50% 以上，其余成分主要为核酸、脂多糖、肽聚糖和其他杂蛋白等^[32]，纯化前通常需要洗涤分离去除杂质。本研究可溶性分析结果显示，重组蛋白KpOmpA主要存在于沉淀中，以包涵体形式存在，经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化后获得较高纯度的重组蛋白。由于重组蛋白错误折叠形成包涵体，其不具有天然结构而失去生物活性，为制备疫苗后续需进行复性实验以恢复其活性^[33]。

4　结论

本研究克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A基因KpOmpA，构建pET-32a-KpOmpA原核表达载体，经双酶切鉴定、测序确认基因序列，重组质粒成功构建，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达得到分子量约为57 kD的重组蛋白，并对该重组蛋白进行了可溶性分析，结果表明KpOmpA重组蛋白以包涵体形式存在。为去除其含有的少量脂类、核酸和其他杂蛋白等杂质，对其进行分离洗涤后使用Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱进行纯化，最终收集到较高纯度的KpOmpA重组蛋白。Western blot鉴定结果表明，该重组蛋白可被小鼠抗His-tag单克隆抗体识别，证实重组蛋白正确表达。