【研究意义】辣椒（Capsicum annuum L.）作为重要的蔬菜作物，在世界广泛种植。中国是世界上种植辣椒的主要国家^[1]。我国气候条件和消费者需求的多样化对辣椒的种质创新提出更高要求^[2]。不断发展的基因工程与植物组织培养技术成为加速和实现辣椒遗传改良的有力辅助工具^[3]。【前人研究进展】科学家们在水稻^[4]、烟草^[5]、番茄^[6]和大豆^[7]等多种植物中顺利开发了遗传转化体系，并创制多个优良品种。尽管辣椒分子育种已取得重要进展^[8]，但目前辣椒的遗传转化体系仍面临较大困难，主要表现为再生反应的基因型依赖性^[9-10]、莲座状芽导致的芽伸长困难^[11]。当前，PEG介导的原生质体转化法^[12]、基因枪法^[13]、病毒介导的基因沉默技术^[14]等方法已应用于辣椒的遗传转化研究，但仍存在愈伤组织难分化、芽难伸长和转化不稳定等问题。与上述方法相比，农杆菌介导法成本低、外源基因拷贝数低、外源基因遗传稳定且操作简单^[15]，因此优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系具有重要意义。Flamingo-bill外植体是一种保留植物一侧子叶和胚根的外植体，由Pozueta-Romero等^[16]首创，并将其应用于辣椒和番茄的再生研究。Flamingo-bill外植体保留的子叶和胚根能够产生营养物质和生长激素，保证不定芽的形成，同时，该外植体具有较高的芽诱导分化能力，且不容易形成簇状芽，解决了辣椒茎伸长培养困难这一难题。目前，Flamingobill外植体已应用于多种植物遗传转化试验中。报告基因产生的蛋白（又称指示分子）在基因工程研究中具有广泛应用。将报告基因与目标基因结合，可以实现基因在植物中的定位、定量和可视化，有利于深入了解目的基因的功能和调控机制^[17]。植物基因研究中常用的报告基因有荧光素酶（Luc）、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和绿色荧光蛋白（GFP）基因等^[18]。Luc具有高灵敏性、易检测、半衰期短等优势，但其在植物中活性相对不稳定，且必须将荧光底物引入植物内部，导致植物的生理活动受到不同程度的干扰^[19]。GUS与底物反应产生的蓝色沉淀可被直观地观察到，常用于鉴定转基因植株，但不适用于目标基因为控制颜色表达的基因，且检测时对植物材料的破坏使得经GUS检测后的材料不能培养再生^[20]。PDS常作为检验病毒诱导的基因沉默载体系统是否有效的报告基因，通过对漂白表型的观察确定转化植株，再用于瞬时表达基因沉默的研究中^[21]。GFP具有异常稳定、可活体实时检测、检测方便、无需底物等优点，被誉为最有潜力的报告基因^[22]。利用GFP优化农杆菌介导的遗传转化在水稻^[23]、黄瓜^[24]、柠檬^[25]等植物中均有报道。GFP在辣椒的遗传转化中也有应用，杨博智等^[26]和Jung等^[27]利用GFP荧光检测技术结合抗生素筛选标记，在辣椒子叶外植体转化试验中筛选出成功转化的愈伤组织。

【本研究切入点】农杆菌介导的遗传转化是将目的基因转移到植物中的有效方法，辣椒中的转基因研究也多用此法，但仍无统一且高效的体系。本研究以GFP为报告基因，通过探讨最适外植体，建立再生体系，并进一步筛选农杆菌侵染浓度、侵染时间及预培养和共培养时间，进而优化农杆菌介导的辣椒遗传转化。【拟解决的问题】通过探究辣椒不同外植体的不定芽分化率、不定根分化率和荧光阳性率，寻求最佳的农杆菌侵染处理和外植体培养时间组合，为辣椒遗传转化体系的优化提供参考。

1　材料与方法 1.1　辣椒材料与表达载体

辣椒品种‘HP’‘8214’‘L55’和含载体pKSE401-35S-GFP（图 1）的农杆菌菌株均由华中农业大学园艺林学学院辣椒功能基因组团队提供。

1.2　辣椒组织培养培养基

本研究中所使用的辣椒组织培养培养基（表 1）主要参照蔡文^[28]的方法，并稍作调整。

1.3　辣椒外植体制备及预培养

将消毒后的辣椒种子接种至无菌苗培养基，待辣椒无菌苗的子叶充分展开、生长点露出后制备外植体。取辣椒幼苗（图 2A），切除子叶尖端和基部，得到子叶外植体（图 2B）；切取2~3 cm的下胚轴段（图 2C），得到下胚轴外植体；切除幼苗一边子叶和生长点（图 2D），Flamingo-bill外植体制备完成（图 2E）。将制备完成的外植体转入预培养基中分别培养1~2 d，用于后续试验。

1.4　农杆菌活化

在含Kan（Kanamycin，卡那霉素）50 mg/L、Rif（Rifampicin，利福平）10 mg/L的LB固体培养基上划线接种转化有pKSE401-35S-GFP载体的农杆菌株，28 ℃恒温培养2 d，获得农杆菌单菌落，4 ℃保存备用。

1.5　外植体与农杆菌共培养

将农杆菌单菌落挑入4~6 mL LB液体培养基（含Kan 50 mg/L、Rif 10 mg/L）中，28 ℃振荡培养12~18 h。再转入100 mL上述LB液体培养基中培养6~8 h，4 000 r/min离心10 min，弃上清。用0.2倍MS液体培养基将菌液分别稀释至浓度为OD₆₀₀=0.5、OD₆₀₀=0.05。再将外植体浸入稀释后的菌液中，分别侵染10、30 min。用无菌滤纸吸干菌液，转入共培养培养基中分别避光培养1、2、3 d。将共培养后的外植体转入筛选及再生培养基进行培养。

1.6　GFP蛋白荧光检测

将不定芽、不定根和愈伤组织放至荧光显微镜（OLYMPUS，SZX7）下检测GFP荧光，并拍照记录。

1.7　转基因辣椒PCR检测

采用TPS法^[29]提取表达GFP荧光的辣椒外植体DNA用于PCR检测，使用Snapgene设计引物，并由昆泰锐生物技术有限责任公司合成。PCR反应体系：DNA模板1.0 µL，上下游引物各1.0 µL，2×Taq Mix 7.5 µL，ddH₂O 4.5 µL。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循环；72 ℃ 5 min。Tublin内参基因、Kan抗性基因、GFP基因和Cas9基因检测引物序列见表 2。

1.8　数据统计与分析

利用EXCEL 2019进行方差分析。采用最小显著差数法（LSD）和新复极差法（SSR）进行多重比较。

2　结果与分析 2.1　不同品种辣椒外植体的不定芽、不定根分化率及荧光阳性率比较

对‘HP’‘8214’‘L55’3个辣椒品种的3种外植体进行无菌培养，并比较其不定芽分化率。由表 3可知，‘HP’‘8214’‘L55’ Flamingo-bill外植体的不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体；3个品种的子叶外植体均未分化出不定芽。表明Flamingo-bill外植体的不定芽诱导能力高于下胚轴和子叶外植体。其中，‘L55’ Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%，因此选用‘L55’进行后续试验。

进一步观察与统计‘L55’的3种外植体数据（表 4、图 3），发现利用Flamingo-bill外植体和下胚轴外植体进行转化均得到了不定芽与不定根（图 3A、B、C、E、F、G），而利用子叶作为外植体转化只得到愈伤组织，未分化成不定芽或不定根（图 3I）。其中，Flamingo-bill外植体的不定根分化率显著高于子叶和下胚轴外植体，且下胚轴与子叶之间的不定根分化率差异不显著。

在3种外植体脱分化形成的全能性愈伤组织中均能观察到绿色荧光（图 3D、H、J），子叶和下胚轴外植体的荧光阳性率均为1.22%，低于Flamingo-bill外植体的荧光阳性率（5.17%），表明‘L55’3种外植体均具有转化农杆菌介导的表达载体的能力，其中Flamingo-bill外植体的再分化与遗传转化能力最强。

2.2　不同农杆菌侵染浓度与时间下‘L55’ Flamingo-bill外植体不定芽、不定根分化率及荧光阳性率比较

对‘L55’Flamingo-bill外植体预处理和共培养1 d后，进行农杆菌不同侵染浓度与时间的组合筛选，发现4个处理条件下的Flamingo-bill外植体均可产生不定芽（图 4A、D、G、J）和不定根（图 4B、E、H、K）。然而在所产生的不定芽中均未观察到GFP绿色荧光，仅在农杆菌处理10 min后的愈伤组织和不定根（图 4C、F）中，以及处理30 min后的愈伤组织中（图 4I、L）观察到绿色荧光，其中，使用浓度为OD₆₀₀=0.05的农杆菌侵染外植体30 min后产生的不定芽分化率和荧光阳性率最高、分别为48.39%、4.84%（表 5）。综上，‘L55’Flamingo-bill外植体在农杆菌不同侵染浓度和时间的4种组合处理下，均可产生表达GFP的脱分化组织，然而再分化形成的不定芽却未能成功表达转化的目的蛋白GFP。

2.3　不同预培养和共培养时间下‘L55’ Flamingobill外植体不定芽、不定根分化率及荧光阳性率比较

将‘L55’Flamingo-bill外植体在浓度为OD₆₀₀=0.05的农杆菌中侵染30 min后，进一步比较不同预培养与共培养时间的组合条件下Flamingo-bill外植体的再生能力及转化效率（图 5），发现6种组合处理能产生不定芽（图 5A、D、G、J、M、P）、不定根（图 5B、E、H、K、N、Q）。然而在不定芽中均未观察到GFP绿色荧光，仅在不定根中观察到绿色荧光（图 5C、F、I、O、R）。且共培养时间相同时，预培养1 d的荧光阳性率和不定芽分化率均高于预培养2 d；预培养1 d共培养2 d（P1C2）条件下的不定芽、不定根分化率、荧光阳性率均最高、分别为48.44%、40.63%和12.50%（表 6）。

2.4　辣椒GFP发光外植体的PCR检测

从上述具有GFP荧光的外植体中随机挑选5个外植体（图 6A~J）进行PCR检测。由图 6K可知，各外植体Tublin内参基因表达均一，表明样品DNA提取成功。同时，GFP、Kan和Cas9基因在5个荧光阳性组织中均有信号，表明农杆菌介导的T-DNA插入成功，并发生稳定的转化。

3　讨论

辣椒愈伤组织不定芽的诱导及芽点的伸长一直是辣椒遗传转化中的难点。在依赖农杆菌介导的辣椒遗传转化研究中，学者们分别利用下胚轴^[30]、子叶^[31]、带柄子叶^[32]、子叶节^[33]、茎尖^[34]、花药^[35]、胚轴的近端部分和胚根^[36]、愈伤组织^[37]等外植体，在不同的辣椒品种中进行遗传转化，然而对于最佳再生材料无统一定论。但研究发现，辣椒Flamingo-bill外植体的不定芽分化率显著高于子叶、带柄子叶和下胚轴^[28]，且芽伸长率也优于子叶、带柄子叶、带柄真叶3种外植体^[38]，这与本研究结果相似。本研究中，与子叶、下胚轴外植体相比，Flamingo-bill外植体的再生能力最佳。而Flamingo-bill外植体再生的不定芽均未表达GFP，表明Flamingo-bill外植体较易产生假阳性不定芽，也同时证明本研究所用GFP荧光指示可在遗传转化早期快速判断转化成功与否，从而减少工作量。

在遗传转化培养过程中，农杆菌侵染浓度与时间是影响转化效果的重要因素。侵染时间过长可能导致后期农杆菌残留且难以控制，引起植株死亡，侵染时间过短则会降低转化效率。本研究发现，辣椒‘L55’Flamingo-bill外植体的较佳农杆菌侵染浓度为OD₆₀₀=0.05、侵染时间30 min。此外，预培养过程也可减轻农杆菌感染过程中对外植体的应激损伤，并促进细胞分裂，使其处于对农杆菌更加敏感的活化状态，易于农杆菌吸附，从而提高外植体的转化效率^[39]。合适的共培养时间既有助于防止农杆菌过度生长而导致外植体严重褐化、死亡，也可避免因农杆菌侵染不充分而导致转化效率降低。本研究中，辣椒‘L55’Flamingo-bill外植体预培养1 d的荧光阳性率显著高于预培养2 d，这可能是由于预培养1 d的Flamingo-bill外植体切口处细胞活力比预培养2 d的更强、更易侵染。因此，预培养1 d共培养2 d更有利于辣椒Flamingo-bill外植体的遗传转化。

在植物遗传转化过程当中，GFP可用于定性检测目的基因是否成功导入。由于其可活体鉴定且操作简单，常被用于外植体发育早期的鉴定。在对黄瓜^[24]和柠檬^[25]进行遗传转化研究时，利用GFP作为报告基因对早期外植体脱分化形成的愈伤组织和继续分化产生的不定芽进行鉴定，GFP的表达情况可准确展示转化结果。本研究中，GFP在愈伤组织、不定根中均有指示；经PCR检测，目标基因阳性结果与GFP荧光检测结果相符，进一步表明GFP基因在辣椒遗传转化中作为报告基因的准确性，可在辣椒转化早期判断转化是否成功。

4　结论

本研究以GFP为报告基因对农杆菌介导的辣椒遗传转化体系进行优化。通过对3个品种的不同外植体、农杆菌不同侵染浓度、侵染时间、预培养和共培养时间进行比较探究，发现辣椒品种‘L55’Flaming-bill外植体的再生能力最佳，其不定芽分化率达77.59%；Flamingbill外植体在浓度为OD₆₀₀=0.05的农杆菌侵染液中侵染30 min的处理效果最佳，其不定芽分化率和荧光阳性率分别为48.39%和4.84%；同时，当Flaming-bill外植体在预培养1 d共培养2 d，其不定芽、不定根分化率最高（48.44%、40.63%），荧光阳性率为12.50%；最终表达GFP荧光的外植体经PCR验证显示T-DNA插入成功，与GFP荧光表达情况一致。