2024, Vol. 51文章信息
引用本文 |
基金项目
- 广东省乡村振兴战略专项资金种业振兴项目（2022-SPY-00-013）；中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目（2023TD58）
作者简介
- 谢希尧（1997—），男，在读硕士生，研究方向为鱼类生物学，E-mail：xiyaoxie999@163.com.
通讯作者
- 区又君（1964—），女，研究员，研究方向为鱼类生物学、发育生物学与水产养殖技术，E-mail：ouyoujun@126.com.
文章历史
- 收稿日期：2023-11-15
2. 大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116000;
3. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306
2. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116000, China;
3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
【研究意义】四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)隶属于鲻形目、马鲅科、四指马鲅属，主要分布于印度洋和太平洋西部，部分分布在我国东海、南海等海域。四指马鲅脂肪含量较高，肉质鲜美、口感细腻，是我国沿海地区的名贵鱼类[1]。近年来，四指马鲅人工繁育技术已经得到突破，并在广东、广西、福建、海南、浙江等沿海地区推广养殖，现已成为具有极高经济价值和发展前景的水产养殖新品种[2]。目前对四指马鲅的胚胎发育[3]、盐度耐受性[4]、消化道结构和功能细胞发育[5]等开展了系统研究。由于四指马鲅的特殊生理结构——鳃盖骨很小、鳃丝面积小且疏离，因此氧气交换能力较差，导致其一旦离开水就会很快死亡，其对应激十分敏感且强烈，在养殖和运输过程中极易因手工操作而受伤死亡[6]，加上捕捞时应激性强、易损伤等原因，因此对其进行麻醉(以减少应激)的相关研究显得十分重要。
近年来，活鱼消费量的急剧增加加速推动了鱼类活体运输产业的发展。基于有水保活运输关键技术，通过停食暂养、添加麻醉剂等方式，不仅能够获得更高的存活率，而且可大大延长活鱼运输时间[7]。在保活运输过程中，由于鱼体代谢作用导致水中氨氮含量有所增加，而氨氮等代谢废物对鱼有较强的毒性作用[8-12]，为了提高运输过程中鱼类的存活率，不仅要提供足够的氧气，还要减缓鱼的代谢活动。使用麻醉剂在很大程度上可以有效降低鱼体的应激反应、游动时导致的机械损伤、相关的渗透调节障碍等，并且还可以降低鱼体代谢，从而减少耗氧和在此过程中产生的代谢物。麻醉剂的作用机理是通过抑制鱼类神经系统的敏感性，降低其对外界环境的应激反应，减缓鱼体新陈代谢速率和呼吸强度，从而达到降低运输损伤和水质污染、提高活鱼运输存活率的目的[2, 13-15]。
【前人研究进展】麻醉剂在日常的水产养殖和动物福利方面占据至关重要的作用，目前已有应用报道的渔用麻醉剂多达60余种，主要是将麻醉剂应用于尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) [11-12]、俄罗斯鲟(Cipenser gueldenstaedt) [13]、白斑狗鱼(Esox lucius) [14]、鲈鱼(Lateolabrax maculatus) [15]、鳊(Parabramis pekinensis) [16]、鲻(Mugil cephalus) [17]、梭鲈(Sander lucioperca) [18]、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus) [19]、钝吻鲟(Acipenser baerii) [20]、大黄鱼(Larimichthys crocea) [21] 等多个品种。麻醉剂在国内外已被广泛用于催产、标志及运输等渔业生产和研究中。在众多渔用麻醉剂中较为常用的是间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222) 和丁香酚(Engenol)。MS-222具有易溶于水、见效快、复苏时间短等优点，根据美国国家食品与药品管理局的规定，经MS-222处理的鱼必须经过21 d的药物消退期后方可在市场上销售[8-10]。MS-222进入鱼体后大部分富集在脾脏和肝脏中，过大剂量、过长时间接触可深及髓质，使呼吸和血管舒缩中心呈麻痹状态，因此肝脏受损和急性缺氧可能是MS-222导致鱼类死亡的主要原因[22]。丁香酚是一种具有丁香花味道、呈微黄色至黄色的液体，不易溶于水，易挥发，使用时需用无水乙醇助溶，具有见效快、复苏时间短等优点。研究表明，鱼体入麻时间随着丁香酚浓度的升高而显著加快，但当丁香酚浓度过高时，会导致试验鱼复苏率降低，严重时还会对鱼体造成不可逆的损伤并导致死亡[23-31]。
【本研究切入点】合理使用麻醉剂能够使鱼体安静，降低采卵、采精和采血等情况下的应激反应，利于操作顺利进行。麻醉剂通过鳃进入鱼体，从而产生麻醉作用。此外，鱼类肝脏与鱼体抗应激息息相关。但目前未见以MS-222和丁香酚为麻醉剂对四指马鲅胁迫的相关研究。【拟解决的关键问题】本研究以四指马鲅幼鱼为研究对象，通过以MS-222和丁香酚为麻醉剂对其进行胁迫，分析不同质量浓度MS-222和丁香酚对四指马鲅幼鱼的麻醉作用和行为特征的影响，明确在本试验条件下四指马鲅幼鱼的抗逆性和药物耐受性，为人工繁育的四指马鲅抗逆性研究以及MS-222、丁香酚作为水产品麻醉剂的使用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料四指马鲅幼鱼由中国水产科学研究院南海水产研究所中山科技成果转化基地自繁自育所得，全长4.5(±0.5)cm，体质量1.5(±0.5)g。2022年7月用水车运输供试四指马鲅幼鱼至南海水产研究所实验室，放入玻璃鱼缸(60 cm×50 cm×45 cm)中，24 h连续充氧暂养7 d。暂养期间每天换水2次(9:30、19:30)，养殖用水经过曝气处理，换水量1/2；于8:00、12:00、18:00和22:00进行饱食投喂，每天观察并记录幼鱼进食情况，水质保持在水温21 (±0.5) ℃、pH值6.8(±0.1)、盐度2~3，试验前禁食1 d。
供试MS-222和丁香酚(浓度≥ 98%)均购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 试验方法2022年8月初随机选取暂养后体质健康、体表无损伤的四指马鲅幼鱼进行试验。试验前使用Sartorius BT 125D(德国)电子天平精确称取一定量的MS-222制备母液(1 000 mg/L)，保存于深色玻璃瓶中；精确称取一定量的丁香酚制备母液(丁香酚︰无水乙醇=1︰9，1 000 mg/L)，封存于玻璃瓶中。参考前人研究[14]，将MS- 222(20、30、35、40、45、50、60 mg/L) 和丁香酚(5、10、20、25、30、40、50 mg/L)各设置7个浓度梯度，并设2个对照(不添加麻醉剂，不充氧；另在丁香酚组的对照中添加同比例无水乙醇)，各组设3个重复，每个重复选取6尾幼鱼(试验幼鱼不重复使用)转移至10 L(装有8 L养殖水)的玻璃鱼缸中，每次试验结束后均更换新鲜的麻醉剂溶液，逐个浓度进行试验。当幼鱼在麻醉剂溶液中浸泡30 min内无法进入下一时期或者达到麻醉期时，立即将幼鱼放入复苏鱼缸中进行复苏，并记录24 h后试验鱼的存活率。试验期间使用秒表记录幼鱼进入麻醉的时间、持续的麻醉时间和复苏时间。参考前人研究的分类标准[30-34] 并结合本试验中四指马鲅幼鱼的具体情况，将幼鱼的麻醉诱导过程分为5个时期，复苏过程分为4个时期(表 1)。
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1.3 样品采集与处理
静水麻醉试验中当幼鱼在麻醉剂溶液中浸泡30 min内无法进入下一时期或者达到麻醉期时，进行采样，将随机捞出的四指马鲅幼鱼迅速放入冰水混合物中冷冻麻醉，取鳃和肝脏组织，然后迅速在生理盐水中漂洗以去除血渍和污物，用吸水纸处理残留后，保存于4% 多聚甲醛溶液中固定备用。
组织切片参照文献[1]和文献[31]的制作方法。取多聚甲醛固定的鳃和肝脏，用长流水冲洗12 h，用50%~100% 乙醇进行梯度脱水(50% 乙醇2 h、70% 乙醇4 h、80% 乙醇2 h、85% 乙醇2 h、95% 乙醇45 min×2次、100% 乙醇45 min×2次)，再用二甲苯进行透明处理(1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合溶液1 h、二甲苯15 min×2次)，浸蜡(石蜡2 h×2次)，用石蜡进行包埋后用Leica切片机进行连续切片，切片厚度4~6 μm，用HE染色和中性树脂封片，在ZEISS Axio Scope.A1型光学显微镜(德国)下观察并摄影记录。
1.4 数据处理采用IBM SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，在单因素方差分析的基础上采用Duncan多重比较法进行分析。
2 结果与分析 2.1 MS-222和丁香酚对四指马鲅幼鱼的麻醉效果本研究中，MS-222和丁香酚各个浓度处理均可对四指马鲅幼鱼产生镇静作用，随着浓度增加，幼鱼进入到相同麻醉时期的时间缩短，其中将幼鱼诱导至轻度镇静期的时间分别从最初的173 s和158 s显著降低到24 s和18 s(P＜0.05，表 1、表 2)。随着2种麻醉剂浓度的上升，麻醉程度随之加深，当MS-222浓度不小于35 mg/L时，麻醉约467 s幼鱼开始出现应激反应；MS- 222浓度为50 mg/L时，可以将部分幼鱼诱导进入麻醉期；60 mg/L时可以在293 s左右将幼鱼全部诱导进入麻醉期。丁香酚浓度不小于25 mg/L时，麻醉291 s幼鱼开始出现应激反应；30 mg/L时可以将部分幼鱼诱导进入麻醉期；40、50 mg/L时分别可以在194、102 s左右将幼鱼全部诱导进入麻醉期(表 1)。幼鱼应激行为特征为惊跃、头部伸出水面、无法保持自身平衡、在水中荡动、腹部斜向上方并往后缓慢游动和咧鳃等。
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2.2 麻醉胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏组织微观结构的影响
通过组织病理学观察发现，对照处理的幼鱼肝细胞体积较大，呈多面体，肝板结构较为清晰；血管收缩且充满红细胞；肝细胞部分区域出现空泡。MS-222各浓度处理与对照相比，20、30 mg/L处理幼鱼的肝细胞纹路清晰、空泡较少，未见其他明显变化；35、40 mg/L处理幼鱼的血管收缩减缓，其中的红细胞数量少，肝板结构清晰；45、50 mg/L处理幼鱼的肝细胞空泡化严重，细胞核位于细胞一侧，肝板结构消失；60 mg/L处理幼鱼的肝细胞整体失去固有形态，细胞核溶解，肝脏基本结构均不清晰(图 1)。
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| A：空白对照；B~H：分别为20、30、35、40、45、50、60 mg/L MS-222处理；HS：肝血窦：BV：血管：HP：肝板：CV：中央静脉：VS：空泡：BC：红细胞：LC：肝细胞：N：细胞核 A: Blank control; B-H: Represent 20, 30, 35, 40, 45, 50 and 60 mg/L MS-222 processing, respectively; HS: Hepatic blood sinusoid; BV: Blood vessel; HP: Liver plate; CV: Central vein; VS: Vacuole; BC: Red blood cell; LC: Hepatocyte; N: Nucleus 图 1 不同质量浓度MS-222麻醉对四指马鲅幼鱼肝脏组织结构的影响（10× 20） Fig. 1 Effects of different mass concentrations of MS-222 anesthesia on the liver tissue structure of juvenile Eleutheronema tetradactylum (10× 20) |
丁香酚各浓度处理与对照相比，5 mg/L处理幼鱼的肝板结构清晰，血管中红细胞数量明显减少；10 mg/L处理幼鱼的肝细胞纹路清晰，细胞核清晰可见，其他未见明显变化，肝细胞空泡较少；20 mg/L处理幼鱼的肝细胞纹路清晰，肝板结构轻微模糊，部分肝细胞核有偏移、溶解等现象，部分区域出现空泡；25 mg/L处理幼鱼的血管收缩减缓，其中红细胞数量少，细胞核溶解现象较为严重；30 mg/L处理幼鱼的肝细胞空泡化严重，只有小部分细胞核位于细胞一侧；40、50 mg/L处理幼鱼的肝细胞肝板结构消失，肝细胞整体失去固有形态，细胞核溶解加剧，肝脏基本结构均不清晰(图 2)。
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| A：空白对照；B~H：分别为5、10、20、25、30、40、50 mg/L丁香酚处理；HS：肝血窦；BV：血管；HP：肝板；CV：中央静脉；VS：空泡；BC：红细胞；LC：肝细胞；N：细胞核 A: Blank control; B-H: Represent 5, 10, 20, 25, 30, 40 and 50 mg/L eugenol processing, respectively; HS: Hepatic blood sinusoid; BV: Blood vessel; HP: Liver plate; CV: Central vein; VS: Vacuole; BC: Red blood cell; LC: Hepatocyte; N: nucleus 图 2 不同质量浓度丁香酚麻醉对四指马鲅幼鱼肝脏组织结构的影响（10× 20） Fig. 2 Effects of different mass concentrations of eugenol anesthesia on the liver tissue structure of juvenile Eleutheronema tetradactylum (10× 20) |
2.3 麻醉胁迫对四指马鲅幼鱼鳃组织微观结构的影响
通过对鳃组织的观察发现，MS-222各浓度处理与对照组的幼鱼，鳃小片均对称分布于鳃丝两侧，鳃小片基部分布着一定数量的线粒体丰富细胞。与对照组相比，各浓度处理幼鱼的线粒体丰富细胞减少，鳃组织受损，部分鳃丝两侧的鳃小片出现细小弯曲，鳃小片末端出现轻微肿涨；当MS-222浓度大于35 mg/L时，各浓度处理幼鱼的部分鳃小片因红细胞过多而胀破；高倍镜下观察发现，鳃小片基底部的粘液细胞和线粒体丰富细胞增多，随着MS-222浓度升高，鳃小片整体水肿和弯曲严重，鳃小片末端出现多处断裂(图 3)。
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| A：空白对照；B~H：分别为20、30、35、40、45、50、60 mg/L MS-222处理；BL：鳃小片；BC：血细胞；PVC：扁平上皮细胞；S：血窦；MRC：线粒体丰富细胞 A: Blank control; B-H: Represent 20, 30, 35, 40, 45, 50 and 60 mg/L MS-222 processing, respectively; BL: Gill lamella; BC: Blood cell; PVC: Pavement cell; S: Blood sinusoid; MRC: Mitochondria-rich cell 图 3 不同质量浓度MS-222麻醉对四指马鲅幼鱼鳃组织结构的影响（10× 20） Fig. 3 Effects of different mass concentrations of MS-222 anesthesia on the gill tissue structure of juvenile Eleutheronema tetradactylum (10× 20) |
与对照幼鱼相比，丁香酚5 mg/L处理幼鱼无明显变化，鳃小片依旧整齐分列于鳃丝两侧；10 mg/L处理幼鱼中可以看到线粒体丰富细胞减少，鳃组织轻微受损，部分鳃丝两侧的鳃小片出现细小弯曲和水肿，基本排列未发生紊乱；20、25 mg/L处理幼鱼的血窦间隙增大，鳃小片末端出现水肿加重的现象，鳃小片排列出现轻微紊乱；30 mg/L处理幼鱼的鳃丝血管收缩，鳃小片末端出现弯曲现象；40 mg/L处理幼鱼的部分鳃小片因红细胞过多而胀破；50 mg/L处理幼鱼的鳃损伤更为明显，主要表现为鳃小片整体水肿且弯曲严重，鳃小片排列紊乱，出现多处断裂、中间血窦开裂(图 4)。
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| A：空白对照；B~H：分别为5、10、20、25、30、40、50 mg/L丁香酚处理；BL：鳃小片；BC：血细胞；PVC：扁平上皮细胞；S：血窦；MRC：线粒体丰富细胞 A: Blank control; B-H: Represent 5, 10, 20, 25, 30, 40 and 50 mg/L eugenol processing, respectively; BL: Gill lamellae; BC: Blood cell; PVC: Pavement cell; S: Blood sinusoid; MRC: Mitochondria-rich cell 图 4 不同质量浓度丁香酚麻醉对四指马鲅幼鱼鳃组织结构的影响（10× 20） Fig. 4 Effects of different mass concentrations of eugenol anesthesia on the gill tissue structure of juvenile Eleutheronema tetradactylum (10× 20) |
3 讨论 3.1 MS-222和丁香酚对四指马鲅幼鱼的麻醉效果
合适的麻醉剂浓度对鱼类的保活运输起至关重要的作用，当麻醉剂浓度较低时，不能对鱼起到麻醉作用，因此并不能有效减少鱼类的应激和鱼类自身因为应激而产生的各种损伤；而麻醉剂浓度过高时，反而会增加鱼体的其他应激反应并对其身体造成伤害[32-34]。本研究结果与上述研究结论相似，不同质量浓度的MS-222与丁香酚对四指马鲅幼鱼的刺激效果有显著差异，当麻醉剂浓度较高时会导致幼鱼死亡，即24 h内致死率随麻醉剂剂量的增大而上升；MS-222与丁香酚对四指马鲅幼鱼具有一定的麻醉效果，且随浓度的提高诱导幼鱼进入同一时期所需的时间明显缩短。相关研究发现，在麻醉过程中MS-222质量浓度过高时，鱼类会表现出焦虑的症状[35]。本研究结果与其相似，当MS-222、丁香酚浓度较高时，四指马鲅幼鱼出现应激，具体表现为惊跃、头部伸出水面、无法保持自身平衡、在水中荡动、腹部斜向上方并往后缓慢游动和咧鳃等；随着MS-222和丁香酚浓度的增加，幼鱼的应激时间明显缩短，进入麻醉阶段的幼鱼总体安静，鳃盖没有张合，此时需要立即将幼鱼转移到清水中进行复苏，否则很可能导致幼鱼死亡。应激是一种普遍存在于鱼类的普遍生理现象，麻醉剂作为一种应激源，在使用过程中很容易造成鱼体麻醉应激，鱼类在感受应激物(应激源)后几乎立刻启动应激反应，适度的应激状态可以产生有利或者积极的效应(即正常应激或良性应激)；而较为严重的应激状态可产生不良的适应性或者负面结果(即痛苦或者不良应激)，长期的应激或者长时间处于应激状态会对机体必要的生命机能(生长、发育、抗病力、行为、生殖等)产生负面影响[26-27]。本研究结果表明，MS-222和丁香酚质量浓度较高时，在短时间内会对鱼体产生一定的镇静作用，但如果长时间进行麻醉，MS- 222和丁香酚会变成新的应激源，使得幼鱼其他的生命机能受到负面影响，从而导致幼鱼死亡。当MS-222浓度过高时，四指马鲅幼鱼进入麻醉的时间过快，超过鱼体的耐受值，会对鱼体产生毒害作用，复苏后幼鱼的存活率明显降低。因此，在采卵、采精、采血等过程中，适当应用麻醉药可起到镇静的作用，减少对鱼类的压力，保证生产活动顺利进行，但在实际养殖过程中要慎用麻醉药，以免使用不当而对鱼体造成其他损害。
3.2 麻醉胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏组织微观结构的影响肝脏是鱼类体内最大且功能最多的腺体器官，可分泌胆汁促进脂肪的分解和吸收，参与体内多种物质的合成、贮存、代谢、转化和分解[1]。本研究结果显示，不同质量浓度的MS-222和丁香酚均可使四指马鲅幼鱼快速进入轻度镇静期，且随着麻醉剂浓度的升高，幼鱼进入麻醉的时间显著缩短，当麻醉剂浓度较低时，幼鱼肝脏细胞出现的空泡较少。已有研究发现，MS-222进入鱼体后大部分富集在脾脏和肝脏中，过大剂量麻醉可深及髓质，使呼吸和血管舒缩中心呈麻痹状态，导致鱼类死亡[26]。本研究结果与其相似，当MS-222和丁香酚浓度过高时，幼鱼肝脏组织开始出现损伤，可能是MS-222和丁香酚质量浓度升高后，麻醉剂成为新的应激源，对四指马鲅幼鱼造成新的应激，使幼鱼肝细胞的自我调节能力逐渐失去作用，部分肝细胞中细胞核萎缩或者消失，随着麻醉剂浓度的升高，肝细胞受损严重，因此高浓度麻醉处理出现部分幼鱼死亡的现象。相关研究表明，在应激胁迫下，幼鱼机体的能量供给主要来自肝脏糖原的分解，肝细胞出现空泡可能是因为应激使得幼鱼能量快速消耗，导致肝糖原或脂肪被分解，从而造成肝细胞出现空泡化[36-38]。本研究结果与其一致，幼鱼受到麻醉应激后，自身会消耗一定能量来应对应激反应，由此加重肝脏的生理负担，肝细胞出现空泡化和排列紊乱。
3.3 麻醉胁迫对四指马鲅幼鱼鳃组织微观结构的影响鳃是鱼类的呼吸器官，鳃小片是其最基本的结构和功能单位，同时也是重要的排泄器官，鳃组织的病变将会导致鱼体摄氧困难、氨氮排泄受阻和血液中氨氮含量增加，影响鱼体内的渗透压调节机能[2, 6, 31]。本研究发现，随着麻醉溶液中MS-222和丁香酚浓度的增加，幼鱼鳃组织受到的损伤更加严重，这可能是麻醉造成幼鱼鳃组织病变，造成幼鱼摄氧困难产生应激，严重情况下将会导致幼鱼死亡。相关研究表明，麻醉剂对鱼体呼吸系统有很强的抑制作用，会使鱼的呼吸频率和鳃组织形态发生改变[36]。与本研究结果一致，MS-222和丁香酚麻醉对幼鱼产生镇静作用，并降低了幼鱼的应激反应，但随着MS-222和丁香酚质量浓度升高，对幼鱼的麻醉时间过长，麻醉胁迫使得幼鱼鳃组织微观结构受到破坏，幼鱼鳃组织形态发生改变，最终对幼鱼正常的生命活动造成不利影响。
4 结论合适的麻醉剂量可以降低鱼体对外界环境的应激反应，减少耗氧。不同质量浓度的MS-222和丁香酚(5 mg/L除外)均可在3 min内对四指马鲅幼鱼产生镇静作用；随着MS-222和丁香酚浓度的升高，将幼鱼诱导至轻度镇静期的时间分别从最初的173 s和158 s降低至24 s和18 s；不同浓度的MS-222和丁香酚均会损伤幼鱼鳃组织和肝脏组织；当二者浓度较低时对组织的损伤较轻，不会影响幼鱼正常的生命活动，但当二者浓度过高时，会加重对幼鱼组织的损伤，对幼鱼产生严重的生理负担并最终导致其死亡。本研究中，当MS-222和丁香酚浓度分别不小于35 mg/L和25 mg/L时，会使四指马鲅幼鱼产生应激反应，当2种麻醉剂质浓度过高、麻醉时间过长和长时间处于应激状态则会导致幼鱼死亡。
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(责任编辑 崔建勋)