2021, Vol. 48文章信息
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基金项目
- 中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630102017002)
作者简介
- 徐磊(1984—)，男，硕士，助理研究员，研究方向为热带旱作遗传改良，E-mail：xulei00100@163.com.
通讯作者
- 刘洋(1980—)，男，博士，副研究员，研究方向为热带旱作遗传改良，E-mail：lyfull@163.com.
文章历史
- 收稿日期：2020-10-27
【研究意义】高粱(Sorghum bicolor)是禾本科高粱属1年生草本植物，不仅是世界上重要的粮食和能源作物，也是优质的饲料作物。高粱具有耐旱、耐涝、耐盐碱等多种特性[1]，其基因组较小(约750 Mb)，具有丰富的遗传多样性，其优良的基因资源在作物改良中具有广阔的应用前景[2]。转录因子又称反式作用因子，对转录过程起诱导或抑制作用[3]。WRKY转录因子作为植物中一类重要转录因子，广泛参与植物生长发育、响应激素诱导和生物及非生物胁迫等生物学进程[4]，开展高粱WRKY基因耐旱性表达特征分析具有重要意义，可为高粱WRKY基因的功能研究奠定基础。【前人研究进展】 WRKY基因家族作为高等植物中备受关注的基因家族之一，自第一个WRKY转录因子基因从甘薯中克隆以来[5]，随着许多物种基因组测序工作完成，越来越多的WRKY基因从基因组水平上鉴定出来，已在青稞[6]、中粒咖啡[7]、大麦[8]和杨树[9]基因组分别鉴定了41、49、98、122个WRKY基因。WRKY转录因子包含1~2个保守WRKY结构域，结构域由约60个氨基酸序列组成，其保守的7个核心氨基酸序列为“WRKYGQK”。根据WRKY保守结构域数目和锌指结构类型，可将WRKY转录因子分为组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ三大类，其中组Ⅱ又分为5个亚类(Ⅱ a~ Ⅱ e)。组Ⅰ WRKY转录因子包含2个WRKY结构域，其锌指结构的氨基酸类型为C2H2，组Ⅱ和组Ⅲ转录因子只含有1个WRKY结构域，锌指类型分别为C2H2、C2HC型[10]。据报道，WRKY转录因子参与了植物生长发育的许多进程，如开花[11]、次级代谢物合成[12]和衰老[13]等。也有较多研究表明，WRKY转录因子响应各种压力胁迫，如玉米ZmWRKY62-like基因响应盐和干旱胁迫[14]；小麦TaWRKY33受盐胁迫诱导表达，TaWRKY33转基因拟南芥比对照具有更好的耐盐性[15]；甜高粱SSWRKY28、SSWRKY76基因的表达结果表明，它们可能在应答干旱胁迫时发挥一定作用[16]；高粱SbWRKY30基因通过影响拟南芥和水稻的根系结构来提高对干旱胁迫的耐受性，拟南芥和水稻的转基因植株在干旱胁迫后脯氨酸含量、SOD、POD和CAT酶活性高于野生型植株，而MDA含量低于野生型植株[17]。【本研究切入点】前人研究结果表明，组Ⅲ WRKY成员广泛参与植物生长发育进程、生物和非生物胁迫应答反应[18]。赵兴奎等[19]已从高粱基因组鉴定了16个组Ⅲ WRKY成员，但没有研究其响应逆境胁迫的表达谱。【拟解决的关键问题】本研究以高粱品种BTx623为试材，采用PEG6000溶液模拟干旱胁迫[20-21]，研究高粱组Ⅲ WRKY成员响应干旱胁迫的表达谱，为挖掘耐旱候选基因提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试高粱品种为BTx623，由广东省旱作节水农业工程技术研究中心保存，该材料有参考基因组序列，为中等耐旱性材料[22]。高粱组Ⅲ WRKY基因信息来自参考文献[19]，基因序列下载自Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。
主要试剂：TransZol Plant植物总RNA纯化试剂盒、Trans2K® Plus DNA Marker、TransStart® Top Green qPCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；ThermoScientific反转录试剂盒K1622，购自Thermo Fermentas公司。
1.2 试验方法1.2.1 干旱胁迫处理 供试高粱种子用1%(W/ W)NaClO溶液浸泡10 min，然后用灭菌的蒸馏水冲洗干净，采用0.5×Hoagland营养液水培，植株在植物光照培养箱中培养，生长条件为28 ℃、12 h光照、12 h黑暗，光照强度为9 600 lx。营养液每2 d更换1次，待植株生长至3叶期，用含20%(W/W)PEG6000的营养液水培，模拟干旱胁迫处理，于处理后0、1、3、6、12 h收集整株植物，每个样本混合6株植物，每个时间点取3个生物学重复样本。
1.2.2 SbWRKY基因的表达谱分析 从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载有关干旱胁迫的高粱28K芯片表达数据(GSE48205)，利用GeneSpring GX 11.5软件(安捷伦科技有限公司)进行分析，获得探针的相对表达倍数，计算log2(fold change)值，然后根据探针对应的基因编号，整理基因的相对表达值。
1.2.3 总RNA提取、cDNA合成及荧光定量表达分析 采用植物总RNA纯化试剂盒提取植株总RNA，对总RNA用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；以总RNA为模板，使用反转录试剂盒获得cDNA，所用Marker为Trans2K® Plus DNA Marker。以cDNA为模板使用qRT-PCR Mix按照操作说明配制反应体系，在LightCycler480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪上进行反应，内参基因选用高粱GAPDH基因。PCR反应体系(10 μL)：cDNA 1 μL，2×Mix 5 μL，上游引物、下游引物(表 1)各0.25 μL，补ddH2O至10 μL；PCR扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，35个循环。
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1.2.4 qRT-PCR结果统计分析 按照2-Δ ΔCT法计算基因相对表达值[23]。使用EXCEL的student’s T检验进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 总RNA完整性检测为保证反转录和qRT-PCR试验顺利开展，本研究对提取的15个总RNA样本进行琼脂糖凝胶电泳检测，其完整性较好(图 1)，可用于后续试验。
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| 图 1 15个RNA样本的琼脂糖凝胶电泳检测 Fig. 1 Detection of 15 RNA samples by agarose gel electrophoresis Trans2KR Plus DNA Marker；16~18：0 h样本；19~21：1 h样本；22~24：3 h样本；25~27：6 h样本；28~30：12 h样本 Trans2KR Plus DNA Marker, 16-18: 0 h samples, 19-21: 1 h samples, 22-24: 3 h samples, 25-27: 6 h samples, 28-30: 12 h samples |
2.2 SbWRKY的基因芯片分析结果
为研究高粱响应干旱胁迫的表达特征，从NCBI数据库下载的高粱28K芯片(GSE48205)包含对照、干旱胁迫、热胁迫和复合胁迫(干旱胁迫和热胁迫共同处理)共4组表达值，将表达值导入GeneSpring GX 11.5软件，经数据过滤、标准化处理、重要性分析和差异分析等流程，最后筛选得到4个组Ⅲ SbWRKY基因的差异表达倍数值(表 2)。由结果可知，SbWRKY14、SbWRKY32下调表达；SbWRKY39在干旱、热胁迫时下调表达，但在复合胁迫时上调表达；SbWRKY41在3种胁迫处理时均上调表达。
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2.3 SbWRKY基因的qRT-PCR分析结果
为研究组Ⅲ SbWRKY基因响应干旱胁迫的表达谱，采用PEG6000模拟干旱胁迫于不同时间点取样，通过qRT-PCR分析基因处理与对照之间的相对表达值，在16个组Ⅲ成员中成功获得了12个基因的表达谱(图 2)；各基因在干旱胁迫处理后不同时间点与对照(0 h)相比，SbWRKY10在处理后3、6 h下调表达，而在处理后12 h上调表达；SbWRKY14在处理后1、6、12 h下调表达；SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在处理后1、3、6、12 h均下调表达；SbWRKY17在处理后1、6、12 h下调表达；SbWRKY39和SbWRKY89在处理后1、3、12 h下调表达；SbWRKY53在处理后1、12 h下调表达，而在6 h上调表达；SbWRKY75在处理后1 h下调表达，而在3、6、12 h上调表达；SbWRKY93在处理后6 h上调表达。
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| 图 2 干旱胁迫下12个SbWRKY基因的表达谱 Fig. 2 Expression profiles of 12 SbWRKY genes under drought stress |
3 讨论
WRKY转录因子在响应各种非生物胁迫方面已有相关报道，WRKY转录因子在植物对干旱胁迫的响应中起重要作用[24]。在拟南芥中过表达TaWRKY1和TaWRKY33激活了几个与逆境相关的下游基因，提高了拟南芥在各种胁迫下的萌发率，促进了根系的生长[25]。在烟草和梨中过表达PbrWRKY53增强了对干旱胁迫的耐受性。与野生型相比，转基因植株的活性氧生成相对更少、抗氧化酶活性和代谢产物更高。此外，在转基因烟草中过量表达PbrWRKY53导致PbrNCED1的表达水平提高；敲除PbrWRKY53可下调PbrNCED1的表达丰度，同时降低其耐旱性[26]。水稻组Ⅲ WRKY转录因子OsWRKY11在干旱和高温胁迫时诱导表达，以热激蛋白HSP101基因作启动子驱动OsWRKY11表达时，转基因植株耐热性和耐旱性增强，叶片萎蔫变慢，离体叶片失水较慢；结果表明OsWRKY11基因在应对高温和干旱胁迫反应中起重要作用，可能有助于提高植物的抗逆性[27]。
为了解SbWRKY基因在干旱胁迫调控中所起作用，本研究利用公共数据库基因芯片表达谱数据，分析高粱组Ⅲ WRKY基因在干旱胁迫、热胁迫和复合胁迫条件下的表达模式，2个基因(SbWRKY14和SbWRKY32)在3种处理条件下均下调表达，1个基因(SbWRKY41)在3种处理条件下上调表达。基因的表达趋势通常反映其相应的功能，在雷蒙德棉中，干旱胁迫处理后，有16个基因(其中包含3个组Ⅲ成员)诱导表达，15个基因表达量减少[28]；本研究通过qRTPCR技术检测出12个基因的表达谱，其中4个基因(SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93)在1个或多个时间点诱导表达，而4个基因(SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42)在所有时间点均抑制表达。这些结果表明，不同的SbWRKY基因在应对干旱胁迫时可能起不同的调控作用。SbWRKY41的qRT-PCR检测结果与基因芯片检测的表达谱呈相反表达趋势，可能是由于两个研究采用的材料、干旱处理方法不同所致：本研究所用试材为BTx623，以20% PEG6000模拟干旱胁迫；而芯片试验所用试材为R16，采用自然干旱胁迫处理[29]。
此外，WRKY转录因子广泛参与了植物生长发育、各种生物及非生物胁迫进程，如在水稻中已验证了16个OsWRKY转录因子的功能，结果表现为Ⅰ类参与抗病进程，Ⅱ b类具有抗病和抗逆功能，Ⅱ d类调控植物的营养生长，而Ⅲ类具有调控营养生长和抗逆等功能[30]。本研究只开展了Ⅲ类基因在干旱胁迫条件下的表达谱分析，这些成员还可能响应低温、高温和高盐等胁迫反应并发挥一定作用。为深入了解这些基因的功能，后续还需克隆这些基因，通过转基因实验验证其生物学功能。
4 结论高粱WRKY转录因子基因在应对逆境胁迫中起重要调控作用，本研究在前人研究基础上挑选16个高粱组Ⅲ WRKY转录因子基因开展进一步研究。通过基因芯片分析结果表明，SbWRKY14和SbWRKY32在3种处理条件下全部下调表达，表明这2个WRKY基因在干旱胁迫、热胁迫和复合胁迫下具有相似功能；SbWRKY41在3种胁迫条件下诱导表达。为进一步分析该组成员的表达谱，以20% PEG6000模拟干旱胁迫，在0、1、3、6、12 h取样，采用qRT-PCR检测出该组12个基因的表达谱；SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93在1个或多个时间点诱导表达，而SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在所有时间点均抑制表达。通过这两种分析方法，筛选到诱导和抑制表达基因，这为我们今后深入了解SbWRKY基因在干旱胁迫中的调控功能提供参考，也为我们克隆耐旱相关基因提供候选基因。
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