文章信息
基金项目
- 建设广东省科学院分支机构项目(2017-2019)
作者简介
- 罗艺(1988—), 女, 壮族, 硕士, 农艺师, 研究方向为作物育种及栽培技术推广, E-mail: 354800412@qq.com.
通讯作者
- 杨俊贤(1962—), 男, 研究员, 研究方向为作物遗传育种与有害生物防治, E-mail: siriyjx@163.com.
文章历史
- 收稿日期:2022-05-17
2. 崇左市江州区农业技术推广站,广西 崇左 532200
2. Agricultural Technology Extension Station of Jiangzhou District, Chongzuo 532200, Chin
【研究意义】千里香(Murraya paniculata)是一种芸香科九里香属小乔木或灌木的药用植物,主要生于疏林或干燥的坡地中,大多分布于广东、海南、广西、湖南、福建等华南以及西南地区[1],属于热带亚热带植物[2]。千里香具有行气止痛、活血散瘀、降血糖、抗生育以及抗肿瘤等多种功效,有利于治疗感冒、风湿骨痛、胃痛和跌打肿痛等症状[3-6],是中成药的主要原料之一,近年来市场需求量逐年增加。目前千里香繁殖的主要方法为自然播种繁殖,但在野生状态下难以开花,致使种子数量少[7],且种子的萌发成功率较低,种子萌动前的贮藏天数较多,完成萌发过程需要较长时间,部分种子存在休眠状态[8],经过自然播种达到的丛芽繁殖系数与生根率较小,难以满足大面积生产种植需求。构建千里香离体再生繁殖体系,可满足千里香种植的种苗需求,为我国三九集团等药企提供可靠的原材料及提供技术保障。
【前人研究进展】近十几年来,关于千里香化学成分和药理方面的研究较多。从千里香中分离鉴定出黄酮类化合物、生物碱、香豆素等物质,发现千里香含有的磷脂酶A抑制剂能够治疗蛇毒引起的肌肉损伤[9-10];叶片的乙醇提取物具有镇痛作用[11];《中国植物信息》记载千里香的根还可用作口腔黏膜表皮的麻醉剂;提取的挥发油也具有抗炎镇痛的作用[12]。这些化合物的发现为千里香的药用价值和应用提供了新的思路[13-16]。在千里香种苗繁育方面,蒋健林等以四数九里香种子为材料研究种子萌发,使用最佳的IBA激素处理萌芽率只能达50%[17]。千里香在诱根方面存在生根数较少和生根率较低的问题,蒋烨用千里香无菌苗进行生根培养,结果表明千里香的出根数和生根率都低[7]。由此可知,千里香的高效繁殖有待进一步提高。
【本研究切入点】以千里香成熟种子所诱导的丛生芽作为增殖材料,利用植物离体培养技术繁殖速度快、系数高的优点,筛选出种子萌发、增殖、壮苗、生根等阶段适宜的培养基配方,以解决其种苗大量增殖与生根的问题,建立千里香离体再生体系。【拟解决的关键问题】本研究利用植物生长调节剂及不同培养基种类,对其再生体系建立的各环节进行探索优化,以期获得高效的离体再生体系,为千里香组培种苗的工厂化生产奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试材料千里香种子由三九集团提供,试验于2021年9月至2022年5月在广东省科学院南繁种业研究所湛江研究中心完成。成熟千里香果实的果皮为黄绿色或者黄褐色,按照果实种子含胚数可分为单胚果实和双胚果实,本试验使用的是单胚果实的种子。挑选形状大小一致、籽粒饱满的种子进行预处理。
1.2 试验方法1.2.1 材料预处理 外植体处理:在超净工作台中,种子用75%酒精处理30 s,无菌水冲洗2次,再用0.1%升汞处理10 min,无菌水冲洗5次,用无菌滤纸吸干水分,种子剥去种皮,接种于萌发培养基上。置于组织培养室进行培养,培养温度为23(±2)℃,平均光照强度为1 200 lx左右,光照时间10 h/d。
试验培养基中蔗糖均为30 g/L,卡拉胶7.0 g/L, pH值在5.8~6.2。马铃薯汁配制方法:市售马铃薯,削皮,切块,称取200 g煮软,使用榨汁机榨成汁液,加水定容至1 L配制成200 g/L浓度。香蕉汁配制方法:市售香蕉,剥皮,称取200 g香蕉加水榨汁,加水定容至1 L配制成200 g/L浓度。
1.2.2 种子萌发培养基的筛选 以MS为基本培养基,设置5种培养基(表 1)进行种子萌发的诱导试验。统计萌发率,获得适宜种子萌发的培养基。
1.2.3 增殖与壮苗基本培养基筛选 根据千里香种胚在芽诱导培养基的发芽情况,分别设置3/2MS、MS、3/4MS、1/2MS 4种培养基(表 2)进行比较试验。每种培养基接种4瓶,每瓶接种6丛。每3 d观察一次生长情况,40 d后观测生长势、色泽、茎粗、落叶、褐化和死亡等指标。
1.2.4 增殖培养基的筛选 以1.2.3筛选的最佳培养基为基本培养基,添加不同浓度6-BA、NAA和IBA(表 3)。将诱导的无菌芽苗顶芽或带腋芽的茎段作为增殖材料,接种到增殖培养基上,每个培养基配方接种4瓶,每瓶接种6株种苗,每株种苗带有2~3个丛生芽。40 d后统计增殖系数(增殖系数=新增殖苗数/接种苗数)与生长势、色泽、茎粗、落叶、褐化和死亡等指标。
1.2.5 壮苗培养基的筛选 以1.2.3筛选的最佳培养基为基本培养基,通过添加马铃薯汁和香蕉汁进行生根前的壮苗培养,将增殖培养获得的丛芽分6个处理组合(表 4),每个处理接种3瓶,每瓶接种6丛。40 d后观察生长状况和测量植株增长高度,筛选出最适宜的壮苗培养基。
1.2.6 生根培养基的筛选 以1/2MS为基本培养基,添加活性炭0.1 g/L,分别添加不同浓度IBA、NAA、IBA+NAA,设置15个处理(表 5)。挑选生长一致的芽苗,切除基部及近基部1~2片叶子,切取长度为2 cm左右、生长健壮的不定芽进行生根培养。每个处理接种4瓶,每瓶接种6株。40 d后统计生根率[生根率(%)=(生根的组培苗数/接种苗数)×100]。
根据以上生根结果对生根培养基进行优化,分别设置不同激素浓度IBA、IBA与NAA组合,并添加马铃薯汁与香蕉汁进行提纯复壮(表 6)。每个处理接种3瓶,每瓶接种6株丛苗。40 d后计算生根率。
1.2.7 炼苗移栽 将生根良好健壮的植株移到温室中进行闭瓶炼苗2~3 d。用镊子夹出,清洗根部的培养基,在植株水分蒸腾量处于较低水平时移植,将其移栽至泥炭土∶黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥(3∶2∶1∶0.2)的混合基质中,洒上浓度0.4 mg/L的生根水使其定根[17],观察统计成活率[成活率(%)=(成活的移栽苗数量/总移栽数量)×100]和苗的生长状况。
试验数据采用Excel进行方差分析,F测验显著后使用新复极差法(SSR)进行多重比较。
2 结果与分析 2.1 种子萌发培养基的筛选由表 1可知,MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培养基种子萌发速度最快,萌发率最高。为节约成本,本试验筛选出最适合种子萌发的培养基配方为MS+6-BA0.5 mg/L,萌发率可达62.5%。
2.2 增殖与壮苗基本培养基的筛选由表 2可知,MS培养基的增殖系数最高,生长势较好,表现最佳,1/2MS培养基生长势一般,3/4MS培养基表现较差,而3/2MS培养基出现落叶、褐化和死亡的现象,与其他3种培养基相比,MS培养基组培苗生长状态最好。
2.3 增殖培养基的筛选由表 3可知,在培养基MS添加6-BA+NAA不同配比中,培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L的丛生芽增殖系数达到2.37,生长势较好,茎秆较粗,芽苗健壮,叶片多且大。培养基MS+6-BA0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L增殖系数出现下降的情况,继续加大6-BA和NAA浓度,增殖系数逐渐提高但其组培苗的生长势一般,黄叶多且叶片稀疏。培养基6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.40 mg/L芽苗的增殖系数急降,生长势弱且出现死亡现象。在培养基MS添加6-BA+IBA不同配比中,其组培苗增殖系数相对比添加同浓度6-BA+NAA培养基的增殖系数低,所有处理增殖系数 < 2,其中培养基MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.30 mg/L的增殖系数最低,仅为1.01,生长势也一般,可知添加IBA对千里香的增殖效果比NAA差。对处理间增殖系数进行方差分析表明,各处理间的增殖系数差异显著。因此,筛选出千里香增殖适宜培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.15 mg/L。
2.4 壮苗培养基的筛选如表 4所示,培养基中添加有机物马铃薯汁的浓度在20 g/L时,组培苗的生长速度最快,植株增长高度大于1 cm,但叶色偏黄,叶片少,茎秆较细,出现叶子掉落现象。添加马铃薯汁30 g/L培养基中组培苗长势较好,植株高度0.93 cm,叶子较浓密,叶片大,茎秆粗壮挺直,且与马铃薯汁浓度为20 g/L相比两组处理间差异不显著。培养基中添加有机物香蕉汁的浓度为20g/L时,组培苗的生长速度最快,但植株生长表现和增长高度不如添加马铃薯汁20 g/L和30 g/L处理,且植株增长高度对比达到显著差异。因此筛选出千里香最佳壮苗培养基配方为MS+马铃薯汁30 g/L。
2.5 生根培养基的筛选由表 5可知,添加IBA的培养基中,生根条数最多的培养基配方为1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭0.1 g/L,生根率为25.0%,但无愈伤组织产生;添加NAA的培养基中,各处理均有愈伤组织产生,但生根效果不理想,其中添加NAA 0.8、1.0 mg/L的培养基中无根系产生,且出现黄叶现象,表明添加NAA对生根的效果不理想;添加IBA+NAA不同配比的培养基中,IBA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L配比生根率最高,但仅为12.5%,愈伤组织也极少。
由表 6可知,与只添加不同配比激素的培养基组培苗相比较,增添有机物的培养基组培苗多数长势较好。在不同浓度IBA的培养基中,1/2MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L的培养基组培苗根系较粗且长,根生长速度较快,叶色较浓绿,生根率最高,达55.6%;在IBA+NAA不同配比培养基中,1/2MS+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性碳0.1g/L+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L或IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基的组培苗生根率较高,达到27.8%。因此,筛选出适合千里香生根培养的培养基配方为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L。
2.6 移栽炼苗种苗经炼苗移栽至泥炭土:黄心土:珍珠岩:钙镁磷肥(3∶2∶1∶0.2)的混合基质中,前期萎蔫严重,注意喷水保湿,3~4 d后开始恢复生长,千里香生根瓶苗移栽成活率达85%,叶片变大,茎秆变粗,除1株叶片变黄之外,其余叶色较绿,后移植于A100杯继续生长,茎叶较为浓绿,茎秆健壮且木质化(图 1)。
3 讨论
在种子萌发培养的研究中,其中生长素的种类及含量对外植体的生长具有重要作用[8],不同培养基对同品种不同部位外植体的诱导也有较大差异[18]。本研究通过诱导促使千里香种子萌发率达62.5%。蒋健林等以四数九里香种子为材料研究不同质量浓度的6-BA、NAA、GA3、IBA对外植体生长的影响,利用IBA处理萌芽率最高,达50%[17]。本研究同样是以千里香种子诱导萌芽,较前人研究萌芽率有所提高。这可能与千里香基因类型不同,诱导所用的培养基和培养条件不同,从而影响了萌芽率。
增殖培养为后期大规模的工厂化育苗关键阶段,基本培养基和香蕉汁对组培苗的增殖影响明显[19],在不同浓度范围内,不同的植物生长调节剂组合对芽的增殖分化有不同影响[20-22]。本研究得出最佳增殖与壮苗的基本培养基为MS培养基,生长状态最好;最佳的增殖培养基其增殖系数为2.37。蒋烨以千里香大田苗诱导出的无菌丛生芽的最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,配方6-BA∶KT∶NAA=1∶1∶1时增殖效果最好,增殖系数达到了9.63[7]。但在本研究中千里香的芽增殖系数仅为2.37,使用NAA处理时,大多数组培苗产生愈伤组织与褐化现象,导致芽无法继续扩繁,而使用IBA处理时相对增殖系数较高。与上述报道相比较,本研究的增殖系数相对较低,上述报道采用的是千里香茎段作为外植体培养,而本研究使用的是成熟种子所诱导的丛生芽作为增殖材料,这可能与试验材料的基因型不同及用作外植体的部位不同有关。
本试验壮苗培养的最佳培养基为MS+马铃薯汁30 g/L,此时芽苗平均高度增长可达1 cm,芽苗长势较好;千里香生根的适宜培养基为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L,生根率达55.6%,以培养的千里香无菌生根苗为材料,通过炼苗移栽后存活率达85%以上。蒋烨使用无菌苗进行生根培养得到的最高生根率为52%[7]。根据本试验观察,千里香的生根培养条件较高,与增殖阶段丛芽生长状态关系较大,本试验结果在千里香种子胚芽诱导、增殖及壮苗阶段获得了较好的结果,可为生产实践提供技术参考,且55.6%的生根率较前人研究有所提高,能满足实际生产的部分需求但仍有提升空间,有待进一步研究。
4 结论本研究结果表明,不同激素及浓度对千里香种子萌发和丛芽增殖过程影响显著,添加马铃薯汁和香蕉汁利于壮苗和生根培养。适宜千里香种子萌发的培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L,萌发率可达62.5%;最佳千里香增殖与壮苗的基本培养基为MS培养基,生长状态最好;最佳的千里香增殖培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.15 mg/L,增殖系数为2.37;最佳的千里香壮苗培养基配方为MS+马铃薯汁30 g/L,此时芽苗平均高度增长可达1 cm,芽苗长势较好;适宜千里香组培苗生根的培养基配方为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L,生根率达55.6%;以培养的千里香无菌生根苗为材料,通过炼苗移栽至泥炭土∶黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥(3∶2∶1∶0.2)的混合基质中成活率达85%以上。
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(责任编辑 杨贤智)