2023, Vol. 50文章信息
引用本文 |
基金项目
- 湖北中烟工业有限责任公司科技项目（2021JCYL3SX2B011）
作者简介
- 潘勇（1971—），男，工程师，研究方向为雪茄发酵工艺，E-mail：sx_panyong@sx.hbtobacco.cn.
通讯作者
- 王剑（1968—），男，高级经济师，研究方向为雪茄烟生产管理，E-mail：wangjian@sx.hbtobacco.cn.
文章历史
- 收稿日期：2022-11-12
2. 华中农业大学生命科学技术学院，湖北 武汉 430077;
3. 华中农业大学园艺林学学院，湖北 武汉 430077
2. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430077, China;
3. College of Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430077, China
【研究意义】近年来，雪茄烟因自身低害、风味特别而备受青睐，进入迅速发展阶段，生产规模不断扩大。而当前采收调制后的雪茄烟叶具有杂气较多、刺激性较大和燃烧性较差等缺点，不能直接用来卷制雪茄，需采用堆垛发酵来改善其香味、吃味等品质[1]。长期以来，雪茄烟叶堆垛发酵完全依赖于传统自然发酵，发酵中的微生物来源于烟叶和环境，易受环境条件的限制，发酵品质不易控制，安全性差，无法满足扩大生产的需要。为此，人工选育雪茄烟优势菌株，开展优势菌株生长条件等优化，实现人工接菌发酵雪茄烟叶，将是雪茄烟产业发展的必然方向。【前人研究进展】现阶段造成雪茄烟叶品质较低的主要原因是烟叶中蛋白质、淀粉、纤维素等大分子物质的含量过高，致使烟叶刺激性较强、青杂气重、吸味辛辣、涩口，并使烟叶的香气不能显露[2-3]。在堆垛发酵中，借助微生物的作用将使这些大分子物质转化成各种小分子甚至挥发性物质[4-8]，烟叶品质得到提高。研究表明，接种微生物发酵烟叶能够降解西柏烯类[9]、类胡萝卜素[10]等烟草香味前体物，还有一些可以有效降解烟碱、甾醇、香豆素等有害化学成分，以此改善雪茄烟叶的外观质量[11-12]，并提高抽吸时的味道和香气质量[9-10]，显著提升发酵品质[13-14]，降低有害物质的含量[15-16]。此外，人工接种微生物发酵可以有效缩短烟叶发酵周期，提高工业化生产效率。微生物应用于烟叶发酵的前提是能够获得更多的菌体，其关键是探究适合微生物生长的环境。多项研究表明，将微生物应用于烟叶发酵前均会对其培养基、接种量、发酵时间和pH等因素进行优化[6, 17-18]，在应用微生物的其他领域也会对微生物的生长环境进行优化，使其处在最佳状态或者提高微生物菌株的某种功能[19-24]。【本研究切入点】人工接菌发酵是烟叶未来工业化生产的必然趋势，为此我们开展了雪茄烟优势菌株的选育，从中筛选出1株具有降解淀粉和蛋白质的优势菌株ZLX10，并进行菌株的鉴定和培养条件优化，为规模化接种发酵雪茄烟叶提供应用基础。【拟解决的关键问题】实现人工接菌规模化发酵雪茄烟叶，需先大量制备菌种，提前优化优势菌株生长条件，尤其是培养基组成和培养条件。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试菌株为本课题组从成品雪茄烟支中筛选的一株对淀粉和蛋白质具有显著降解效果的优势菌ZLX10。采用牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基（牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、固体琼脂20 g/L、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0）活化和扩大培养菌种。试验于2022年4月在华中农业大学微生物农药国家工程研究中心完成。细菌鉴定试剂盒由青岛海博生物有限公司生产，其他试剂均为国产化学纯。
1.2 菌株培养将优势菌株ZLX10保存在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，挑取单菌落，以牛肉膏蛋白胨液体培养基进行振荡培养8~12 h，培养温度为37 ℃，获得菌株培养液。
1.3 菌株鉴定1.3.1 菌株测序鉴定 将优势菌ZLX10的培养液以4 000 r/min离心5 min，收集菌体，用苯酚氯仿抽提法提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为细菌16S rDNA基因测序通用引物27F/1492R，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，并由该公司完成测序。测序结果在NCBI数据库进行序列比对分析，选择同源性最高的物种作为鉴定结果。
1.3.2 菌株生理生化特性测定 参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏系统细菌学手册》的方法[25-26]，采用青岛海博生化试剂盒检测菌株的生理生化指标，包括耐盐性、柠檬酸盐利用、丙酸利用、氧化酶、接触酶、甲基红、V-P测定、淀粉水解、葡萄糖氧化培养、硝酸还原、明胶液化、吲哚试验和产H2S试验，具体测定方法参照试剂盒说明书进行。
1.4 菌株培养条件优化1.4.1 培养基成分的种类筛选 以液态牛肉膏蛋白胨培养基为基础，对培养基中原有成分碳源（葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、乳糖和木糖）[27-28]、氮源（有机氮源大豆蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、尿素和无机氮源硫酸铵、硝酸钾）[29-30]和无机盐（硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化钠、碳酸钙、硫酸铵）的浓度分别进行单因素试验，分析其对菌株生物量的影响。碳源和氮源的添加浓度均为15 g/L，无机盐的添加浓度为1.5 g/L，以37 ℃、180 r/min培养24 h后测定培养液的OD600值。
1.4.2 培养基成分的浓度筛选 确定最佳碳源、氮源和无机盐的种类后，分别比较其不同浓度对菌株生物量的影响。碳源、氮源浓度梯度均为5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，无机盐的浓度设0.05~1.25 g/L共7个梯度，以37 ℃、180 r/min培养24 h后测定培养液的OD600值。
1.4.3 培养基优化 根据以上培养基的成分和浓度优化试验结果，选择氮源、碳源和无机盐开展3因素3水平的正交试验[L9(34)]，优化筛选出最优培养基配方[31-32]。
1.4.4 培养条件优化 菌株ZLX10选择装液量（每250 mL装30、50、70 mL）、接种量（1%、2%、5%，V/V）、种龄（12、18、24 h）进行3因素3水平正交试验（L9(34)）优化[31, 33]，筛选最优培养条件。
1.4.5 培养条件验证 菌株ZLX10以优化前的培养条件和优化后的最佳培养条件进行接种培养，将培养液稀释成系列浓度，涂布计数，对比优化前后培养液中的活菌数。
1.5 数据分析数据整理和图表制作使用Excel 2009、GraphPad Prism7.0进行分析与绘制。所有试验均3次重复。
2 结果与分析 2.1 ZLX10菌株的鉴定对从雪茄烟支中筛选出的优势菌株ZLX10的16S rDNA进行测序，经在NCBI数据库进行比对分析，显示菌株ZLX10与莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis（MT043920.1）的序列同源性达到99.86%，据此初步确定优势菌株ZLX10为芽孢杆菌。进一步分析其芽孢杆菌生理生化特性，由表 1可知，菌株ZLX10耐盐，能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，不含丙酮酸脱羧酶，葡萄糖氧化发酵为氧化型；该菌株的淀粉水解和明胶液化均为阳性，表明该菌株具有较强的多糖和蛋白大分子降解能力；此外，该菌株的丙酸利用、氧化酶、接触酶、吲哚试验等均为阴性。综合可知，优势菌株ZLX10为莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis（MT043920.1）。
2.2 培养基对菌株ZLX10生长的影响
2.2.1 不同碳源对菌株ZLX10生长的影响 以牛肉膏蛋白胨培养基作为基础培养基，分别选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉和乳糖作为碳源，添加量均为15 g/L，无机盐和氮源保持不变，进行液体振荡培养。由图 1A可知，不同种类的碳源对ZLX10的生长有显著影响；菌株ZLX10由蔗糖培养的培养液吸光度最大、为6.425，比葡萄糖培养液高45.88%，比麦芽糖培养液高47.59%，比甘油培养液高43.7%，比乳糖培养液高77.29%，并与其他种类差异显著，为最佳碳源。
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| 图柱上小写英文字母不同者表示差异显著 Difference lowercase letters above the column represent significant differences 图 1 不同碳源（A）和不同浓度蔗糖（B）培养的菌株ZLX10生物量 Fig. 1 Biomass of strain ZLX10 cultured by different carbon sources (A) and sucrose concentrations (B) |
进一步选择不同浓度的蔗糖培养菌株ZLX10，结果（图 1B）显示随着蔗糖浓度升高，菌株ZLX10培养液的吸光度也随之升高；当蔗糖添加量为60 g/L时，菌株ZLX10培养液的吸光度达到最大、为10.672，并与其他浓度处理之间有显著差异，因此蔗糖的最佳浓度为60 g/L。
2.2.2 不同氮源对菌株ZLX10生长的影响 以牛肉膏蛋白胨培养基为基础培养基，选取4种有机氮源和两种无机氮源培养24 h，结果如图 2A所示。将酵母提取物作为氮源时，菌株ZLX10培养液的吸光度最大、达到9.873，与其他氮源间存在显著差异；尿素、硫酸铵和硝酸钾分别作为氮源时，几乎没有吸光度；大豆蛋白胨的吸光度高于蛋白胨的吸光度，因此最佳氮源选择酵母提取物。以不同浓度的酵母提取物培养菌株ZLX10，结果如图 2B所示。随着酵母提取物浓度上升，培养液的吸光度逐渐升高；当酵母提取物添加量升至15 g/L时，培养液的吸光度最大、达到10.067，与除20 g/L浓度外的吸光值差异显著；继续提高酵母提取物的浓度，培养液的吸光度呈现下降趋势。确定酵母提取物的最佳浓度为15 g/L。
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| 图柱上小写英文字母不同者表示差异显著 Difference lowercase letters above the column represent significant differences 图 2 不同氮源（A）和不同浓度酵母提取物（B）培养的菌株ZLX10生物量 Fig. 2 Biomass of strain ZLX10 cultured by different nitrogen sources (A) and yeast extract concentrations (B) |
2.2.3 不同无机盐对菌株ZLX10生长的影响 以牛肉膏蛋白胨培养基作为基础培养基，分别选取NaCl、KH2PO4、FeSO4·7H2O、MgSO4、CaCO3作为无机盐，氮源和碳源的处理相同，液体培养24h后测定OD600，结果如图 3A所示。FeSO4·7H2O和MgSO4的吸光值相近，差异不显著，但显著高于其他无机盐培养的吸光值。FeSO4·7H2O在培养基配制过程中溶解度较低，易生成沉淀，不利于微生物生长利用。多次试验比较显示，FeSO4·7H2O的OD值低于MgSO4的，为此选择MgSO4作为最适无机盐。进一步优化MgSO4的添加量，在预试验中增加MgSO4添加量，发现均不利于菌株ZLX10生长，而降低添加量却有利于菌株ZLX10生长，故在0.05~1.25 g/L浓度区间设7个添加量梯度。结果（图 3B）显示，随着MgSO4添加浓度的增加，菌株ZLX10培养液的生物量整体呈现先增加后降低的变化趋势；当浓度为0.25 g/L时，菌株ZLX10培养液的生物量最高，且明显高于其他浓度，确定MgSO4的最优浓度为0.25 g/L。
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| 图柱上小写英文字母不同者表示差异显著 Difference lowercase letters above the column represent significant differences 图 3 不同无机盐（A）和不同浓度硫酸镁（B）培养的菌株ZLX10生物量 Fig. 3 Biomass of strain ZLX10 cultured by different inorganic salts (A) and MgSO4 concentrations (B) |
2.2.4 碳源、氮源和无机盐对菌株ZLX10生长的影响 根据以上培养基的成分和浓度优化的试验结果，选择蔗糖（50、60、70 g/L）、酵母提取物（10、15、20 g/L）、MgSO4（0.20、0.25、0.30 g/L），开展3因素3水平的正交试验[L9(34)]，选出菌株ZLX10培养基最优配比。由表 2可知，各因素对生物量大小的影响为酵母提取物＞MgSO4＞蔗糖。其中最优组合为A1B3C2，即菌株ZLX10的最优培养基配方为：蔗糖50 g/L、酵母提取物20 g/L、MgSO4 0.25 g/L。
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2.3 不同培养条件对菌株ZLX10生长的影响
对菌株ZLX10开展种龄、接种量和装液量的3因素3水平正交试验[L9(34)]，试验结果如表 3所示。由表 3极差分析可知，各因素对生物量大小的影响为装液量＞种龄＞接种量，其中最优组合为A3B1C1，即菌株ZLX10的最优培养条件为接种量1%（V/V）、装液量30 mL、种龄24 h。
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2.4 最佳培养条件对菌株ZLX10生长的影响
综合以上对菌株ZLX10最适培养基配比和最适培养条件的研究结果，确定优化后的菌株ZLX10培养基为：蔗糖50 g/L、酵母提取20 g/L、MgSO4 0.25 g/L，培养条件为：接种量1%（V/V）、装液量30 mL、种龄24 h。将菌株ZLX10在优化后的最佳培养条件下培养24 h后，生物量是优化前的1.98倍。
3 讨论 3.1 莫海威芽孢杆菌的广泛应用从雪茄烟支中分离出的优势菌株经鉴定为莫海威芽孢杆菌，之前未见报道，但在其他方面报道较多。吴宁[33]从工业大麻籽内生菌中筛选出产很强果胶酶活性的莫海威芽孢杆菌；李晓梅[34]从山西老陈醋发酵过程中筛选出多株产酯、多酚、乙偶姻、酸均较高的莫海威芽孢杆菌优良菌株。还有研究从棉花秸秆中分离到可以降解棉酚的莫海威芽孢杆菌，对棉籽油具有一定的脱毒作用[35]。刘丹彤等[36]在醋醅模拟培养基中添加莫海威芽孢杆菌川芎嗪生成量显著提高。莫海威芽孢杆菌可以产生抑菌成分，可以拮抗金黄色葡萄球菌[37]。还有研究指出，从醉马草（Achnatherum inebrians）[38]、矮生嵩草（Kobresia humilis）[39]等内生菌中分离鉴定的莫海威芽孢杆菌，对马铃薯的炭疽病菌、坏疽病菌、枯萎病菌均有较好拮抗作用[40]，可以作为生防菌。汤茜等[41]从土壤中筛选到的1株具有良好降解氯虫苯甲酰胺能力的莫海威芽孢杆菌。侯宁等[42-43]从受石油污染的土壤中选育出1株具有较强破乳能力的莫海威芽孢杆菌，其24 h破乳率大于83%。有报道指出，莫海威芽孢杆菌是引起铁皮石斛组培苗污染的内生细菌[44]。由此可见，不同来源的莫海威芽孢杆菌具有不同的功能特性，来源于雪茄烟中的莫海威芽孢杆菌也可以用于发酵雪茄烟叶。
3.2 莫海威芽孢杆菌的生长条件能够作为微生物碳源的物质很多，对于大多数微生物来说糖类是最好的碳源。有机氮源可提供菌株对各种生长因子的需求，酵母提取物是公认的优良有机氮源[33]。微生物生长繁殖和代谢产物的合成都需要无机盐，不同无机离子对不同菌株生长产生不同影响[31]，不同来源的莫海威芽孢杆菌对生长条件要求一定差异存在。莫海威芽孢杆菌ZA1的最佳培养基配比为氯化铵14.25 g、玉米粉19 g、马铃薯237 g、水1 000 mL、pH7.7，最佳增殖培养温度为28 ℃、转速为180 r/min、发酵时间为36 h，优化后的活菌数为4.12×1010 CFU/mL[45-46]。也有报道指出，生防菌莫海威芽孢杆菌ZA1分泌抑菌物质的最佳培养基为马铃薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水l 000 mL、pH6.9，最佳培养温度为17.8 ℃，装液量为20 mL/150 mL三角瓶，培养方式为暗处理振动培养，培养时间为96 h[47]。莫海威芽孢杆菌J7产生抑菌物质的最适发酵培养基为Landy培养基，其中蔗糖和酵母浸粉分别为最适碳源和氮源，30 ℃、36 h培养、培养基初始pH 7.0、接种量6% 为最适发酵条件[48]；其中蔗糖添加量、酵母浸粉添加量和发酵温度是影响莫海威芽孢杆菌J7抑菌物质产生的3个主要因素；经过优化后的蔗糖添加量为16.9 g/L，酵母浸粉添加量为6.6 g/L，发酵温度为29.7 ℃，其他成分不变，优化后等量培养基内的抑菌物质产量提高了38.89%。莫海威芽孢杆菌作为破乳菌体生长的最佳发酵条件为培养温度25 ℃、摇床转速160 r/min、pH 9、接菌量10%、培养时间40 h[49]。由此可见，培养基成分和培养条件对莫海威芽孢杆菌的生长有明显影响，因此对来源于雪茄烟中莫海威芽孢杆菌进行生长条件优化具有必要性。
4 结论经16S rDNA测序和生理生化鉴定，从雪茄烟支中分离的菌株ZLX10为莫海威芽孢杆菌。碳氮源为微生物生长代谢过程中必不可少的营养物质，选择适合菌株生长的培养基对于菌株生物量的提升有重要意义。本研究对菌株ZLX10的培养基配方和培养条件进行优化，研究了不同碳氮源种类、不同碳氮源浓度和重要无机盐浓度，以及装液量、接种量和种龄对菌株ZLX10液态培养生物量的影响，结合单因素试验和正交试验得到更佳的菌株培养工艺。菌株ZLX10培养基配方为：蔗糖50 g/L、酵母提取物20 g/L、MgSO4 0.25 g/L；培养条件为：接种量1%（V/V）、装液量250 mL中装30 mL、种龄24 h。菌株ZLX10在优化后的培养条件下培养24 h后，生物量是优化前的1.98倍。研究结果为大规模培养菌株实现人工接种发酵雪茄烟叶提供了应用基础。
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(责任编辑 白雪娜)