【研究意义】普洱茶是以云南大叶种晒青绿茶为原料加工而成的一种后发酵茶类，按照加工工艺及品质特征分为普洱茶生茶和普洱茶熟茶两种类型^[1]。普洱茶生茶是云南生产的传统历史名茶，具有适宜长期存放的特点。传统普洱茶（生茶）的存放属于后发酵，后发酵是云南大叶种晒青毛茶或普洱茶生茶在特定的环境条件下，经微生物、酶、湿热、氧化等综合作用，其内含物质发生一系列转化，形成普洱茶独有品质特征的过程^[1]。研究证明，普洱茶及其有效成分具有抗氧化、抗肿瘤、减肥、降血脂、降血糖、抗疲劳、抗病毒、杀菌消炎、保护神经等多种功效^[2-3]。目前，有关不同储存年份的普洱茶生茶抗氧化活性主要通过体外酶方法进行研究，而对其体内抗氧化的研究则鲜有报道。

【前人研究进展】马冰凇等^[4-5]对普洱茶（生茶）仓储陈化过程中的化学成分变化规律和体外抗氧化能力进行了研究，结果表明普洱茶（生茶）仓储陈化过程中茶多酚、游离氨基酸、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子酸儿茶素没食子酸酯（GCG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等酯型儿茶素极显著降低，杨梅素和没食子酸含量极显著增加，没食子儿茶素（GC）、表儿茶素（EC）和表没食子儿茶素（EGC）等非酯型儿茶素呈先增加后降低的变化趋势，咖啡碱、可可碱和槲皮素含量无显著变化；体外抗氧化能力试验结果表明普洱茶（生茶）新茶的铁离子还原/ 抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力较陈茶高，而超氧阴离子自由基清除能力则比陈茶低。戚康标等^[6]对不同储存时间普洱茶生茶和熟茶的生化成分和抗氧化活性进行了研究，结果发现随着存放时间的增加，普洱茶生茶和熟茶的茶多酚、氨基酸和可溶性糖含量均显著下降，其体外抗氧化活性也明显减弱。孙世利等^[7]研究了不同年份普洱茶生茶物质基础和体外总抗氧化活性的变化，结果表明随着贮存时间的增加，普洱茶生茶的茶多酚、儿茶素、氨基酸、咖啡碱含量显著下降，没食子酸、可溶性糖、茶红素和茶褐素含量显著增加，茶黄素含量则变化不大，体外总抗氧化活性差别较小。

【本研究切入点】本研究以不同储存时间普洱茶生茶为试材，测定分析其生化成分的变化规律及其在自然衰老小鼠体内抗氧化能力的差异。【拟解决的关键问题】通过测定比较不同储存时间普洱茶生茶生化成分的含量，探讨不同储存时间对普洱茶生茶抗氧化能力的影响，以期为普洱茶生茶资源的开发利用提供试验依据。

1　材料与方法 1.1　试验材料

试验于2021年12月至2022年5月在广东省茶树资源创新利用重点实验室进行。供试云南普洱茶生茶分别产于2014、2020年，由北京快雪堂茶业有限公司提供。

小鼠规格：SPF级C57BL/6雄性小鼠，10月龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。饲养条件：小鼠饲养于25（±2）℃恒温环境中，相对湿度为50%~60%，光照12 h/d，自由摄食饮水，在SPF级动物房适应性饲养1周后进行试验。

试剂：谷丙转氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，ALT/GPT）测试盒、谷草转氨酶（Glutamic oxalacetic transaminase，AST/GOT）测试盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）测试盒、微量还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）测试盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测试盒，均购自南京建成生物工程有限公司。BCA蛋白定量测试盒，Thermo Fisher Scientific；8种儿茶素单体儿茶素（Catechin，C）、没食子儿茶素（Gllocatechin，GC）、儿茶素没食子酸酯（Catechin gallate，CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechin-3-gallate，GCG）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin-3-gallate，ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG），购自Sigma公司；咖啡碱、没食子酸，购自上海源叶生物技术有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯；其他试剂均为分析纯。

试验仪器和设备：TriStar LB941多功能酶标仪（德国Berthold Technologies公司）；高速冷冻离心机Eppendorf、1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；JH-12-06型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；OHAUS准微量电子天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；ZMQS5001型Millipore纯水仪（密理博公司）。

1.2　试验方法

1.2.1 普洱茶生茶水提物的制备　按茶水比（W/ V）1:30在95 ℃水浴中用沸蒸馏水浸提20 min，重复浸提2次，浸提结束后过滤得到茶汤滤液，合并两次茶汤滤液，进行旋转蒸馏浓缩，冷冻干燥成冻干粉后，置于干燥器内密封避光保存备用。

1.2.2 普洱茶生茶生化成分测定　按照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》测定茶叶水分含量，按照国家标准“GB/T 8305-2013茶水浸出物测定”测定茶水浸出物含量，按照国家标准“GB/T 8313—2018茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法”测定茶多酚含量，按照国家标准“GB/T 8314—2013茶游离氨基酸总量的测定”测定茶叶中的游离氨基酸总量，采用蒽酮- 硫酸比色法测定可溶性总糖含量，采用三氯化铝比色法测定黄酮类含量。儿茶素单体、没食子酸、咖啡碱含量参照国家标准“GB/T 8313—2018茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法”进行测定，并进行了改进，具体色谱条件如下：

色谱柱：phenomenex C₁₈柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）；检测波长280 nm；检测温度28 ℃；流动相A：含0.5% 乙酸、1% 乙腈和2% 甲醇的水溶液，流动相B：含0.5% 乙酸、10% 乙腈和20% 甲醇的水溶液；洗脱步骤：在30 min内，A相由72.5% 到20%，B相由27.5% 到80%，30 min后在5 min内，A相由20% 恢复到72.5%，B相由80% 恢复到27.5%，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。以外标法按峰面积进行定量。

1.2.3 普洱茶生茶体内抗氧化活性测定　（1）小鼠分组与给药。取供试小鼠30只，随机分成3组，每组10只，分别设为正常对照组、2014年普洱茶生茶组（2014年产的普洱茶生茶水提物，1 000 mg/kg·BW）、2020年普洱茶生茶组（2020年产的普洱茶生茶水提物，1 000 mg/kg·BW）。适应性饲养1周后，第2周开始每天对小鼠进行普洱茶生茶水提物灌胃，正常对照组用蒸馏水灌胃，连续灌胃21 d，每天灌胃1次，自由摄食、饮水，每隔3 d测量记录小鼠体重、进食量和饮水量；第21 d灌胃前禁食12 h，自由饮水，对各组小鼠进行给药处理，末次灌胃结束1 h后麻醉小鼠，进行心脏取血，解剖取肝脏、肾脏和脾脏组织称重。

（2）小鼠肝脏ALT、AST、SOD活性和GSH、MDA含量的测定。采血完成后处死小鼠，迅速解剖取出肝脏，用预冷生理盐水漂洗并用滤纸吸干。剪取少量肝组织加入9倍体积预冷的生理盐水进行匀浆，于4 ℃、2 500 r/min离心15 min，得到上清液。按照试剂盒说明书的方法测定肝脏组织中ALT、AST、SOD活性和GSH、MDA含量。肝组织定量蛋白按照BCA蛋白定量测试盒说明书的方法对肝组织上清液进行蛋白定量。

（3）小鼠血清中AST、SOD活性和MDA含量的测定。收集小鼠血液静置30 min后，于4 ℃、3 000 r/min离心20 min，分离得到血清，按照试剂盒说明书的方法检测血清中AST、SOD活性和MDA含量。

试验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行绘图和统计分析，结果以x±s表示，采用t检验（Student’s t test）或单因素方差（one-way ANOVA）分析差异显著性。

2　结果与分析 2.1　不同年份普洱茶生茶生化成分分析比较

由表 1可知，2014年的普洱茶生茶水浸出物、氨基酸、咖啡碱含量分别为40.11%、3.15%、4.18%，2020年的普洱茶生茶水浸出物、氨基酸、咖啡碱含量分别为40.78 %、3.32%、5.83%，前者这3个成分含量均极显著低于后者；前者的没食子酸含量（0.38%）极显著高于后者（0.20%）。由表 2可知，2014年普洱茶生茶的GC、EGC、C、EC、EGCG、CG含量分别为0.21%、0.84%、0.61%、2.46%、6.90%、0.10%，非酯型儿茶素含量（4.11%）、酯型儿茶素含量（13.44%）和儿茶素总量（17.55%）均极显著低于2020年的普洱茶生茶。综上，随着储存时间的增加，普洱茶生茶的水浸出物、氨基酸、咖啡碱及儿茶素含量均有所下降，没食子酸则有所增加。

2.2　不同年份普洱茶生茶对老龄小鼠体重、饮水量和进食量的影响

由图 1A可知，灌胃21 d后，正常对照组小鼠体重与初始体重相比没有显著增加，各给茶组小鼠体重与初始体重相比有所下降，但差异不显著，与正常组相比差异也不显著。图 1B、C结果表明，在试验期间，正常组小鼠饮水量和进食量呈现先增加后减少趋势，各给茶组小鼠的饮水量和进食量也呈现出相同的趋势，与正常组相比，给茶组小鼠的饮水量和进食量有所下降，但差异均不显著。

2.3　不同年份普洱茶生茶对老龄小鼠脏器指数的影响

小鼠脏器指数的变化可以间接反映动物体衰老的程度。肝脏、肾脏是动物机体重要的代谢器官，若肝肾指数降低，会影响动物代谢能力；脾脏是动物体内的免疫器官，脾脏重量若降低、萎缩可使动物免疫功能下降。由图 2可知，试验结束时，与正常对照组的老龄小鼠相比，各给茶组小鼠的肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数稍有下降，但差异均不显著。

2.4　不同年份普洱茶生茶对老龄小鼠肝脏和血清中ALT和AST活性的影响

ALT和AST活性偏高是反映肝脏功能不正常的一个重要指标，体内炎症和氧化应激均可引起ALT和AST活性偏高。由图 3A、B可知，与正常对照组小鼠相比，给茶组小鼠肝脏的ALT和AST活性有所下降，但未达到显著差异。图 3C结果表明，正常对照组小鼠血清AST的活性为59.60 U/L，2014年普洱茶生茶组小鼠血清AST活性为21.49 U/L，2020年普洱茶生茶组小鼠血清AST活性为29.50 U/L，给茶组小鼠血清的AST活性均极显著下降（P＜0.01）。

2.5　不同年份普洱茶生茶对老龄小鼠肝脏和血清SOD活性、GSH和MDA含量的影响

SOD是机体主要抗氧化酶，保护细胞免受氧化应激损伤。由图 4A可知，与正常对照组小鼠肝脏SOD活性（288.53 U/mgprot）相比，给茶组小鼠肝脏SOD的活性（363.41、343.53 U/mgprot）均有所增加，但均未达到显著差异；图 4B的结果也显示，与正常组对照组小鼠血清SOD活性（38.59 U/mL）相比，给茶组小鼠血清SOD活性（38.52、34.79 U/mL）均未有增加。

GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物，其含量越高，机体抗氧化能力越强。由图 4C可知，正常对照组小鼠肝脏GSH含量为19.17 μmol/ gprot，2014年普洱茶生茶组小鼠肝脏GSH含量为77.28 μmol/gprot，2020年普洱茶生茶组小鼠肝脏GSH含量为41.54 μmol/gprot。可见，与正常对照组相比，给茶组小鼠肝脏GSH含量均明显增加，差异极显著（P＜0.01）。

MDA含量可间接反映机体细胞损伤程度，其含量越高，机体脂质过氧化程度越高，细胞损伤程度也越高。由图 4D可知，正常对照组小鼠肝脏MDA含量为1.78 nmol/mgprot，2014年普洱茶生茶组小鼠肝脏MDA含量为1.16 nmol/ mg prot，2020年普洱茶生茶组小鼠肝脏MDA含量为1.32 nmol/mgprot，与正常组对照组相比，给茶组小鼠肝脏MDA含量均有所下降，但未达到显著差异。图E的结果表明，与正常对照组小鼠血清MDA含量（18.53 nmol/mL）相比，2014年普洱茶生茶组小鼠血清MDA含量（17.78 nmol/mL）略有下降，2020年普洱茶生茶组小鼠血清MDA含量（11.67 nmol/mL）下降较多，但均未达到显著差异。

3　讨论

传统的普洱茶生茶是以符合普洱茶产地环境条件下生产的云南大叶种茶树鲜叶为原料，经杀青、揉捻、日光干燥、蒸压成型等工艺制成的紧压茶，而后存放中经微生物、酶、湿热、氧化等综合作用，其内含物质发生一系列转化，形成普洱茶独有品质^{[1, 8-9]}。有研究者采用代谢组学方法研究普洱生茶贮存过程中内含物质的变化，结果显示普洱生茶在贮存前期内含物质变化不大，贮存5年后其内含物质才有明显变化^[10]。众多研究结果表明，随着贮存时间增加，普洱茶生茶的茶多酚和氨基酸的含量明显减少，没食子酸含量明显增加^{[4-7, 11]}，本研究结果与前人的研究结果相符。马冰凇等^[4]研究发现，随着贮存时间增加，普洱茶生茶的儿茶素总量及儿茶素单体中酯型儿茶素EGCG、GCG、ECG的含量明显下降，非酯型儿茶素GC、EC、EGC的含量呈先上升再下降的趋势，咖啡碱的含量则变化不大；孙世利等^[7]研究结果表明，儿茶素总量、8种儿茶素单体以及咖啡碱的含量均随着贮存时间增加而减少；宋莹等^[11]的研究显示，儿茶素总量和咖啡碱的含量变化不明显。本研究中，2020年产的普洱茶生茶的儿茶素总量、各儿茶素单体和咖啡碱的含量均比2014年产普洱茶生茶高，这与孙世利等^[7]的研究结果相符。马冰凇等^[4]、戚康标等^[6]研究表明，普洱茶生茶的可溶性糖含量随着贮存时间增加呈下降趋势，孙世利等^[7]的研究结果则相反，而宋莹等^[11]研究表明可溶性糖含量变化不明显。本研究结果显示，2014年产普洱生茶的可溶性糖含量比2020年的高。综上，随着储存时间的增加，普洱茶生茶中茶多酚、儿茶素、氨基酸含量呈减少趋势，没食子酸含量呈增加趋势，咖啡碱、可溶性糖等的含量可能受茶叶原料、贮存条件和时间等影响而表现出不同的变化规律，这有待进一步研究。

根据Denh am Harman衰老的自由基学说，其认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的^[12]。天然抗氧化活性物质被人体吸收后，能提高体内相关抗氧化酶类活性，可直接清除自由基^[13]。国内外大量研究结果表明，茶叶及其有效成分在体内和体外均具有良好的抗氧化活性^[14-19]。本研究以自然衰老小鼠为研究对象，探讨不同储存时间普洱茶生茶的体内抗氧化能力。随着年龄增长，机体内的器官逐渐衰竭，功能活性呈下降趋势。ALT和AST分布于人体多个器官组织中，其中肝脏内含量最多，当肝组织细胞受到损伤时，肝脏细胞和血清中的ALT和AST活性会提高^[19]。本研究结果显示，储存时间较长的普洱茶生茶（2014年）能极显著降低老龄小鼠血清和肝脏的AST活性，储存时间较短的普洱茶生茶（2020年）除了能极显著降低老龄小鼠血清和肝脏的AST活性外，还能极显著降低肝脏的ALT活性。衰老的自由基理论认为，随着年龄的增加，体内抗氧化酶活性及非酶性抗氧化物含量下降，过氧化产物增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基大量积聚，造成组织细胞的过氧化损伤^[20]。SOD是机体的主要抗氧化酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤^[21]。本研究结果表明，灌胃普洱茶生茶后老龄小鼠肝脏的SOD活性有所增加，但与正常对照组相比没有达到显著差异，且对老龄小鼠血清中的SOD活性没有影响。GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收，维持红细胞膜的完整性、脱氧核糖核酸的生物合成、细胞的正常生长发育及细胞免疫等多种重要生理功能。GSH是一种低分子清除剂，可清除O^2-、H₂O₂、LOOH，因而GSH含量是衡量机体抗氧化能力的重要因素^[22]。本研究结果表明，通过灌胃普洱茶生茶后，老龄小鼠肝脏的GSH含量与正常对照组相比均有所增加，其中2014年产普洱茶生茶的GSH含量极显著增加。MDA含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度^[23]。本研究发现，不同云南古茶树茶水浸提液后，给茶组小鼠肝脏的MDA含量与正常对照组相比均有所下降，但未达到显著差异。可见，不同储存时间普洱茶生茶均具有体内抗氧化作用并有所差异，这可能与其存放过程中儿茶素生化成分变化有关，不同储存时间普洱茶生茶的体内抗氧化作用分子机制有待进一步研究。

4　结论

与2020年普洱茶生茶相比，2014年普洱茶生茶的水浸出物（40.11%）、氨基酸（3.15%）、咖啡碱（4.18%）、GC（0.21%）、EGC（0.84%）、C（0.61%）、EC（2.46%）、EGCG（6.90%）、CG（0.10%）、非酯型儿茶素（4.11%）、酯型儿茶素（13.44%）和儿茶素总量（17.55%）均极显著下降，而没食子酸含量（0.38%）极显著增加，且随着存放时间的增加普洱茶生茶的生化成分差异较大。2014年普洱茶生茶可极显著地降低老龄小鼠血清的AST活性（21.49 U/L），提高肝脏GSH的含量（77.28 μmol/gprot）、SOD活性，降低肝脏的AST活性和MDA含量；2020年普洱茶生茶可极显著地降低老龄小鼠血清的AST活性（29.50 U/L），提高肝脏的SOD活性和GSH含量，降低肝脏的ALT和AST活性以及肝脏和血清中的MDA含量。不同储存时间普洱茶生茶均具有体内抗氧化作用并表现出差异，储存时间较长的普洱茶生茶提高体内抗氧化酶类SOD活性和提高GSH含量的能力较强。