【研究意义】饲用抗生素可提高畜禽生产性能、减少疾病，但其广泛应用导致畜禽产品药物残留问题，也促使细菌耐药性的产生，严重威胁食品安全和人体健康。因此，世界各国对饲用抗生素纷纷采取限制措施。根据农业农村部要求，从2020年7月1日起，我国饲料生产企业必须停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。这标志着我国畜牧业发展进入绿色发展阶段，“禁抗、减抗、限抗”已成为畜牧业高质量发展的必然趋势，研究抗生素替代品是行业发展的迫切需求。

【前人研究进展】目前抗生素替代品的研究主要集中在天然植物（包括中草药）、益生菌和酸化剂等方面。其中，植物提取物是通过物理、化学等方式从植物中提取的单一或混合的化合物，具有促生长、抗氧化、抗菌和增强免疫等功效^[1]。植物精油作为一类重要的植物提取物，是植物的天然挥发性油类，通常由几十种不同的化学物质组成，含量较高的几种化学物质可占总量的70%^[2-3]，这些成分对植物精油的生物学功能影响极大。目前关于植物精油抑杀病原微生物、抗氧化、消炎等研究很多^[4]。据报道，肉豆蔻与肉豆蔻衣精油对大肠杆菌、葡萄球菌等具有抑菌作用^[5]，罗勒精油可提高肠道内溶菌酶的活性^[6]。此外，植物精油可以提高肉鸡的抗氧化能力，如在肉鸡日粮中添加鼠尾草精油和迷迭香精油，其胸肌和腿肌的抗氧化能力更好，胆固醇氧化产物更低^[7]。研究表明，肉豆蔻精油能提高铁离子的还原能力，罗勒精油能使氧化酶mRNA表达降低^[8-9]。

肠道微生物是动物肠道中共生的一个庞大的微生物族群，细菌是其最重要的组成部分。研究表明，超过100万种微生物在肉鸡肠道定殖，其基因相当于肉鸡全基因组的40~50倍^[10]。正常肉鸡的肠道菌群具有免疫屏障、营养代谢和促进生长发育等作用，是鸡生理功能中不可或缺的一环，因此肠道菌群平衡对肉鸡健康具有重要意义^[11]。研究表明，肉鸡的生长性能不同，其肠道菌群组成也存在显著差异^[12-13]，肉鸡的生产性能与肠道菌群密切相关。

【本研究切入点】前期研究发现，肉豆蔻和罗勒复方精油对鸡产气荚膜梭菌具有良好的体外抑菌作用，在鸡坏死性肠炎的人工发病模型试验中表现出良好的预防效果^[14]。但该复方精油对规模养殖黄羽肉鸡的应用效果还不清楚。【拟解决的关键问题】本研究开展黄羽肉鸡规模养殖试验，在日粮中添加肉豆蔻和罗勒复方精油预混剂，评价该复方精油对集约化饲养黄羽肉鸡主要生产性能指标的影响；并对肠道菌群16S rDNA V₃~V₄可变区进行高通量测序，分析肉豆蔻和罗勒复方精油对肉鸡肠道菌群的影响，探讨其作用机制，为肉豆蔻和罗勒复方精油在黄羽肉鸡生产中应用提供参考。

1　材料与方法 1.1　试验材料

供试的复方精油预混剂（以下简称“复方精油”）由肉豆蔻精油和罗勒精油配制（含精油20%），由广东省农业科学院动物卫生研究所提供。

供试的黄羽肉鸡为江村黄鸡商品雏鸡（1日龄，♀），由广州市江丰实业股份有限公司提供。

试验用基础日粮为玉米- 小麦- 豆粕- 菜粕型日粮，参照国家农业行业标准《黄羽肉鸡营养需要量》（NYT/3645-2020）进行配制，为颗粒状配合饲料。日粮组成和营养水平见表 1。

1.2　试验分组与饲养管理

随机将3 942只1日龄黄羽肉鸡分为空白对照（EOCON）、复方精油低剂量（EOL）和复方精油高剂量（EOH）3个处理组，分别饲喂基础日粮、添加0.025% 和0.05% 复方精油预混剂的基础日粮。每个处理6个重复，每个重复219只黄羽肉鸡。

试验于2020年7—9月在广州市江丰实业股份有限公司花都鸡场进行。试验期为60 d，肉鸡全程自由采食，由乳头式饮水器供水。1~35日龄在育雏舍饲养，35日龄后转移至育成舍。每天记录各处理组的饲料消耗量、健康状态和死亡情况等。

1.3　生产性能指标测定

60日龄时统计黄羽肉鸡生产性能相关数据，包括各处理组的合格鸡体质量（＞1.3 kg）、合格存活个体数、死淘数以及饲料消耗量。计算各处理组肉鸡的平均合格品出栏率、平均日采食量、平均体质量以及料肉比等。

合格品出栏率（%）=出栏合格活体数/219×100

1.4　肠道菌群分析

60日龄时，每个处理组随机抽取5只鸡，脱颈处死，无菌操作取空肠（以其卵黄蒂为起点，上下各5 cm）和盲肠内容物，干冰暂存，随后送到实验室-80 ℃冰箱中保存备用。

采用天根生物科技有限公司的粪便基因组DNA提取试剂盒，按说明书提取肠道内容物细菌DNA。根据细菌16S rDNA V₃~V₄可变区进行引物设计，引物序列为：338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' 和806 R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

PCR反应体系（20 μL）：4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，0.4 μL FastPfu聚合酶，0.2 μL BSA，10 ng模板DNA，dd H₂O加至20 μL。

PCR反应程序：95 ℃预热3 min；95 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，之后保持10 ℃。

PCR产物利用2% 琼脂糖电泳进行检测，合格产物送至上海美吉生物有限公司进行高通量测序。利用Illumina测序平台，将得到的PE reads根据Overlap关系进行拼接，并对序列进行质量控制。然后进行OTU聚类分析和物种分类分析，进一步对群落组成进行统计学分析和可视化分析。

1.5　数据分析

肠道菌群数据采用SPSS26软件进行统计学分析，采用Kruskal-Wallis检验对门和属的相对丰度进行比较，采用Benjamini Hochberg法进行P值校正。生产性能数据采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。

2　结果与分析 2.1　复方精油对黄羽肉鸡生产性能的影响

由表 2可知，复方精油组与空白对照组的合格品出栏率均无显著差异；复方精油高、低剂量组的平均采食量均极显著低于空白对照组（P < 0.01），其中复方精油高剂量组的采食量为空白对照组的86.6%；各组之间平均体质量和平均日增重没有显著性差异；两复方精油组的料肉比极显著高于空白对照组（P < 0.01），饲料转化率均提高11.4%。

2.2　复方精油对黄羽肉鸡空肠菌群的影响

黄羽肉鸡空肠菌群共检测到OTU 585个，分属于308种178属89科48目17纲11门1界。

2.2.1 黄羽肉鸡空肠样品物种组成Venn图分析结果　由图 1可知，复方精油高剂量组、低剂量组和空白对照组共有的OTU数目为154个，复方精油高剂量组特有的OTU数目为30个，复方精油低剂量组特有的OTU数目为194个，空白对照组特有的OTU数目为34个。复方精油低剂量组的OTU数量最多，其次为复方精油高剂量组。

2.2.2 复方精油对黄羽肉鸡空肠菌群α多样性指数的影响　由表 3可知，各组空肠菌群Coverage指数均大于0.995，即各组样品检测覆盖率均达到99.5% 以上，说明检测结果可信。各组样品空肠菌群的Sobs指数、Shannon指数和Simpson指数均没有显著性差异，说明各组空肠菌群的多样性、丰富度、均匀度表现一致。

2.2.3 黄羽肉鸡空肠菌群稀释曲线分析结果　由黄羽肉鸡空肠菌群物种稀释曲线（图 2）可见，随着样本测序深度的增加，表观实际观测到的物种丰度在OTU水平上不断增加。但所有曲线最终趋于平缓，表示测序深度足够，数据量合理，实际观测到的物种数目能够覆盖空肠内容物样品中的菌群物种。

2.2.4 复方精油对黄羽肉鸡空肠菌群组成的影响　由表 4可知，黄羽肉鸡空肠菌群中相对丰度≥总丰度0.1% 的细菌门有9个。9个门中占据优势的是厚壁菌门（相对丰度＞90%）和放线菌门（相对丰度＞1%）。复方精油高、低剂量组疣微菌门的相对丰度均显著低于空白对照组（P < 0.05）。各组间空肠菌群的厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度比值（F/B）无显著性差异。

黄羽肉鸡空肠菌群中相对丰度≥总丰度0.1% 的细菌属有8个（表 4），8个属中占优势的均为乳杆菌属（相对丰度＞80%），各组间该属相对丰度差异不显著。复方精油低剂量组空肠假单胞菌属、双歧杆菌属和韦荣氏球菌属的相对丰度均显著高于空白对照组（P < 0.05），复方精油高剂量组的片球菌属相对丰度显著高于空白对照组（P < 0.05）。

2.3　复方精油对黄羽肉鸡盲肠菌群的影响

黄羽肉鸡盲肠共检测到OTU 917个，分属于383种189属84科45目20纲12门1界。

2.3.1 黄羽肉鸡盲肠样品物种组成Venn图分析结果　由图 3可知，复方精油高剂量组、复方精油低剂量组和空白对照组共有的OTU数目为671个，复方精油高剂量组特有的OTU数目最多、为54个，其次为复方精油低剂量组、为35个，空白对照组特有的OTU数目最少、为21个。

2.3.2 复方精油对黄羽肉鸡盲肠菌群α多样性的影响　由表 5可知，各组盲肠菌群Coverage指数均大于0.995，即各组样品检测覆盖率均达到99.5% 以上，说明检测结果可信。各组Sobs指数、Shannon指数和Simpson指数均无显著差异，表明复方精油对盲肠菌群的多样性、丰富度、均匀度没有影响。

2.3.3 黄羽肉鸡盲肠菌群稀释曲线分析结果　由黄羽肉鸡盲肠菌群物种稀释曲线（图 4）可见，随着样本测序深度的增加，实际观测到的物种丰度在OTU水平上不断增加。但是所有样本的稀释曲线最终趋于平缓，表示测序深度足够，数据量合理，实际观测到的物种数目能够覆盖盲肠内容物样品中的菌群物种。

2.3.4 复方精油对黄羽肉鸡盲肠菌群组成的影响　黄羽肉鸡盲肠菌群中相对丰度≥总丰度1% 的细菌门有8个（表 6）。由表 6可知，黄羽肉鸡盲肠优势菌是厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota），其次是放线菌门（Actinobacteriota）和蓝藻门（Cyanobacteria）。

复方精油低剂量组的弯曲杆菌门（Campilobacterota）和蓝藻门（Cyanobacteria）相对丰度显著高于空白对照组（P < 0.05），复方精油高剂量组的变形杆菌门（Proteobacteria）相对丰度显著高于空白对照组（P < 0.05）。复方精油低剂量组的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度显著高于复方精油高剂量组（P < 0.05），拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度显著低于复方精油高剂量组（P < 0.05），且其厚壁菌和拟杆菌相对丰度比值（F/B）显著高于复方精油高剂量组（P < 0.05）。

黄羽肉鸡盲肠菌群中相对丰度≥总丰度1% 的细菌属有13个（表 6）。13个属中各组优势属均为拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）、另枝菌属（Alistipes）、Clostridia UCG-014、Christensenellaceae R-7属、粪杆菌属（Faecalibacterium）以及瘤胃球菌属（Ruminococcus）。

复方精油高、低剂量组的Clostridia_vadinBB60_group和另枝菌属相对丰度均显著低于空白对照组（P < 0.05），复方精油高剂量组的Clostridia_UCG-014相对丰度显著低于空白对照组（P < 0.05），复方精油高剂量组拟杆菌属相对丰度显著高于空白对照组和复方精油低剂量组（P < 0.05），复方精油低剂量组瘤胃球菌属相对丰度显著高于空白对照组（P < 0.05）。

3　讨论

植物精油对肉鸡生长性能具有一定的促进作用。魏全意等^[15]研究发现，植物精油净力安能显著提高肉鸡的生产性能，提高机体消化吸收能力和免疫力。黄金昌等^[16]研究指出，在鸡饮水中添加水溶性植物精油200 ~ 400 mL/t能提高白羽肉鸡出栏时的体质量，降低死亡率，提高欧洲效益指数。李彬等^[17]研究表明，饲料中添加30 mg/kg复合植物精油能有效改善麻黄肉鸡平均日采食量和料重比。这些研究结果与本试验结果一致，本试验中肉豆蔻和罗勒复方精油能够显著降低黄羽肉鸡的料肉比。

肠道菌群能影响宿主的新陈代谢、生理和免疫系统，维持肠道菌群结构平衡，对机体健康有利^[18]。本试验在日粮中添加肉豆蔻和罗勒复方精油后，肉鸡空肠和盲肠仍保持原有的菌群平衡，有益于肠道健康。已有研究表明，植物精油能增加盲肠的OTU数，提高盲肠中细菌的多样性^[19]。本研究发现，复方精油增加了黄羽肉鸡空肠和盲肠的OTU数，表明复方精油能提高空肠和盲肠的细菌多样性。

植物精油对肠道菌群具有一定的调节作用。Koutsos等^[20]发现，植物精油能够降低鸡盲肠中大肠杆菌、肠球菌和葡萄球菌的数量，增加肠道内乳酸菌的数量。Seyyed等^[21]认为，日粮中添加600 mg/kg罗勒精油能显著降低鸡肠道菌群内大肠杆菌的菌落数。Matulyte等^[22]报道，肉豆蔻精油能抑制肉鸡肠道内粪肠球菌和多杀性巴氏杆菌的生长。郑建怡等^[23]指出，多种植物精油能改变肉鸡肠道内的微生物菌群数量，增加有益细菌数量，减少有害细菌数量。这些研究结果与本试验结果一致，肉豆蔻和罗勒复方精油能够提高肉鸡肠道菌群中双歧杆菌的相对丰度，降低梭菌属的相对丰度。

在空肠肠道菌群研究方面，张伯池等^[24]报道，添加600 mg/kg复合植物提取物可显著增加肉鸡空肠菌群中疣微菌门丰度，表明复合植物提取物有利于肠道内有益细菌的定植，使肠道处于较为健康的状态。假单胞菌属和双歧杆菌属均属于双歧杆菌科^[25]。研究发现，双歧杆菌能够调节肠道菌群，促进有益菌生长，抑制有害菌生长，提高肠道的抵抗力和免疫力，有助于轻度肠道感染的控制^[26]。肠道菌群中，韦荣氏球菌属的存在与疾病缓解或稳定相关^[27]，片球菌属能够调节肠道菌群并维持肠道微生态平衡^[28]。本研究表明，饲粮中添加肉豆蔻和罗勒复方精油可显著降低菌群中疣微菌门的相对丰度，显著提高空肠假单胞菌属、双歧杆菌属、韦荣氏球菌属和片球菌属的相对丰度，说明肉豆蔻和罗勒复方精油能够增加空肠内有益菌的丰度。

在盲肠肠道菌群研究方面，Akram等^[29]报道，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是肉鸡盲肠的主要菌群，三者相对丰度之和甚至超过90%。胡永飞等^[30]报道，鸡盲肠菌群中拟杆菌门占优势。随着日龄增加，鸡盲肠菌群结构逐渐发生变化，厚壁菌门相对丰度逐渐降低，拟杆菌门相对丰度逐渐升高^[31]。本试验黄羽肉鸡60日龄时，占据盲肠菌群优势地位的是厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门。其中，放线菌门成为盲肠优势菌是因为该菌门中的双歧杆菌丰度较高。

值得注意的是，厚壁菌门和拟杆菌门对鸡的代谢和免疫有重要意义，其中两者的相对丰度比值（F/B）是近年来备受关注的热点。研究表明，F/B比值与脂肪的沉积呈正相关，高脂食物可提高该比值^[32]。冯宇等^[33]研究发现，肠道菌群中F/B比值降低，有助于改善肉鸡代谢、减少脂肪沉积。但本试验中肉豆蔻和罗勒复方精油组的F/B比值与空白对照组差异不显著。

据报道，动物肠道菌群中一些厌氧菌属能产生短链脂肪酸，降低肠道内的pH值，增加肠道内酸度，促进有益菌增殖，改善肠道菌群结构^[34]。乳酸菌属在代谢中可产生多种短链脂肪酸，抑制有害菌生长，还可产生多种氨基酸和多种维生素，为动物机体提供额外营养^[35]。拟杆菌属细菌可利用葡萄糖发酵产生乙酸、琥珀酸，降低pH值，抑制有害菌生长^[36]。杨建平等^[37]报道，饲粮中添加复合植物精油，瘤胃菌科的Ruminococcaceae UCG-005属、厌氧球菌属的相对丰度显著降低，unidentified_Ruminococcaceae的相对丰度显著升高，说明复合植物精油对瘤胃菌科相关属细菌有双向调节作用。同时，研究发现，Clostridia_UCG-014、Clostridia_vadinBB60_group等梭菌属数量增多会造成动物机体肠道微生态紊乱，并引发腹泻^[38]。另枝菌属为拟杆菌门中新发现的细菌属，与肠道炎症密切相关^[39]。本研究发现，肉豆蔻和罗勒复方精油能显著提高鸡盲肠菌群中拟杆菌属和瘤胃球菌属相对丰度，显著降低鸡盲肠菌群中Clostridia_vadinBB60_group属、Clostridia_UCG-014属和另枝菌属的相对丰度，表明添加复方精油能够增加盲肠菌群中有益菌属的相对丰度，降低有害菌属的相对丰度，保持肠道菌群健康状态。

4　结论

肉豆蔻和罗勒复方精油可显著降低黄羽肉鸡的料肉比，饲料转化率提高11.4%。饲喂肉豆蔻和罗勒复方精油后，黄羽肉鸡空肠和盲肠的优势菌依然是厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门等，放线菌门中重要的益生菌- 双歧杆菌属仍为优势属。同时，复方精油可显著提高空肠双歧杆菌属、假单胞菌属、韦荣氏球菌属和片球菌属及盲肠拟杆菌属、乳酸菌属和瘤胃球菌属等有益菌的相对丰度，可显著降低空肠疣微菌门、盲肠有害梭菌属等的相对丰度。可见，饲喂肉豆蔻和罗勒复方精油能够促进黄羽肉鸡空肠和盲肠的有益菌生长，抑制有害菌增殖，改善肠道菌群，维持菌群平衡，利于肠道健康，明显提高黄羽肉鸡的生产性能。本研究结果为肉豆蔻和罗勒复方精油作为饲料添加剂在肉鸡生产中推广应用提供了有力依据。